Chitinase sinh tổng hợp từ vi sinh vật được chia làm hai loại chính: chitinase nội bào và chitinase ngoại bào
Đối với chitinase nội bào, giải phóng enzym ra khỏi vi sinh vật (cụ thể Garrido (1994) đã tách beta-galactosidase ra khỏi nấm men [40], Illanes (1995) tách lactase ra khỏi nấm men [56], hoặc enzym được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn [18, 140]) nhờ phá vỡ tế bào bởi phương pháp nghiền [32, 135]; bởi phương pháp đồng hóa [31, 94]; bởi phương pháp sóng siêu âm, máy nén, sốc nhiệt [65]; bởi phương pháp hóa học dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate,…
Đối với chitinase ngoại bào từ vi sinh vật do được tiết thẳng vào môi trường nuôi cấy tế bào nên có thể thu dịch chiết enzym dễ dàng.
Tuy nhiên dịch chitinase ngoại bào thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzym thấp và khó bảo quản. Do đó cần phải có các bước tách tạp chất rắn và sinh khối tế bào thu nhận dịch chiết enzym. Thực hiện các bước này bằng ly tâm, lọc, vi lọc [39, 79],.. và cô đặc dịch enzym nhằm tăng nồng độ bằng phương pháp siêu lọc, hoặc kết tủa bằng các tác nhân dung môi hữu cơ (ethanol hay acetone,..) hoặc muối trung tính (hay dùng nhất là amonium sulfate)).
1.5.1. Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym
Tách tạp chất (phần sinh khối và tạp chất không tan) có ở dịch chitinase được thực hiện bằng phương pháp li tâm, lọc, vi lọc. Phương pháp li tâm hay được sử dụng nhất do thời gian ngắn và có thể thực hiện ở qui mô phòng thí nghiệm lẫn công nghiệp. Tốc độ li tâm phụ thuộc vào kích thước tế bào vi sinh vật và độ nhớt dịch sau lên men. Dịch
chitinase được thu từ dịch sau sinh tổng hợp bởi Stenotrophomonas maltophilia bằng ly tâm tốc độ 7000 v/p trong thời gian 20 phút [47], từ Aeromonas sp. DYU-Too7 bằng ly tâm tốc độ 2280 v/p ở 4ºC trong thời gian 15 phút [85], từ Bacillus licheniformis Mb-2 bằng ly tâm tốc độ 10000 v/p ở 4ºC trong thời gian 20 phút [156], từ Stenatrophomonas maltophilia[58] bằng ly tâm tốc độ 10000 v/p trong thời gian 20 phút. Kumar và cs (2012) tách tạp chất thu nhận exochitinase từ Trichoderma asperellum UTP-16 bằng ly tâm tốc độ 2240 v/p ở 4ºC trong thời gian 10 phút [75].
1.5.2. Cô đặc dịch chiết enzym
Do enzym có bản chất protein dễ bị biến tính bởi nhiệt độ cao, dịch enzym sau khi loại bỏ tạp chất rắn được cô đặc bằng phương pháp cô đặc chân không ở nhiệt độ thấp hoặc cô đặc bằng phương pháp siêu lọc qua màng. Siêu lọc qua màng được xem là phương pháp tốt nhất hiện nay để cô đặc dịch chiết enzym. Bởi vì phương pháp này được thực hiện ở nhiệt độ thấp nên có thể giữ hoạt tính enzym tốt nhất, ngoài ra còn dễ dàng thực hiện ở qui mô lớn và cho hiệu suất thu hồi cao. Kích thước màng siêu lọc sử dụng cô đặc enzym phụ thuộc vào kích thước enzym muốn cô đặc. Enzym chitinase thu nhận từ các vi sinh vật có kích thước khác nhau nhưng lớn hơn 20 kDa, do vậy nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp siêu lọc với kích thước màng lọc 10 kDa thu hồi dịch chitinase như từ Stenotrophomonas maltophilia [47], từ Aeromonas sp. DYU-Too7[85], từ Bacillus licheniformis Mb-2 [156], từ Stenatrophomonas maltophilia[58].
1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH NAG TỪ DỊCH THỦY PHÂN CHITIN
1.6.1. Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất
Dung dịch chứa NAG sau thủy phân chitin được ly tâm tốc độ 2000 v/p trong 20 phút để loại bỏ phần tạp chất; ly tâm ở 4ºC loại chitin dư bị kết tủa bởi cồn tuyệt đối (EtOH) và thu dịch nổi chứa NAG [10]. Ly tâm loại bỏ phần chitin dư, sau đó loại enzym bởi màng siêu lọc và thu dịch NAG [7]. Setthakaset và cs (2008) đã loại bỏ cặn rắn bằng cách lọc qua màng lọc, loại bỏ màu bằng than hoạt tính [132].
Ngoài ra phương pháp siêu lọc với các màng lọc kích thước khác nhau nhằm thu sản phẩm xylo-oligosaccharides và xyloglucan có khối lượng phân tử thấp [78].
1.6.2. Cô đặc
Cô đặc là quá trình nâng cao nồng độ chất khô của dung dịch. Quá trình cô đặc được thực hiện nhằm các mục đích khác nhau:
Mục đích chuẩn bị: cô đặc nhằm chuẩn bị cho một số quá trình tiếp theo (như quá trình kết tinh, quá trình lọc,..)
Mục đích bảo quản: do sau cô đặc thì nồng độ chất khô tăng, nên hạn chế sự phát
triển của vi sinh vật và kéo dài thời gian bảo quản.
Mục đích hoàn thiện: tăng nồng độ chất khô theo yêu cầu làm chất lượng tăng lên
và hoàn thiện hơn.
Tiến hành cô đặc bằng các phương pháp:
Phương pháp nhiệt: sử dụng nhiệt để cô đặc đối với các sản phẩm sinh học thường khó khăn vì các sản phẩm này rất nhạy cảm với nhiệt độ. Quá trình cô đặc nhiệt là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng hoạt chất sinh học trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính sinh học cũng tăng cao. Tuy nhiên phải kiểm soát điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính sinh học mới được bảo toàn.
Phương pháp siêu lọc: là phương pháp sử dụng màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ. Được sử dụng rộng rãi để thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng 1000 – 300.000 Da. Người ta thường sử dụng cellulose acetate và các polymer hữu cơ như: poly sulfone, polyvinylidene và polypropylene làm nguyên liệu màng lọc.
Phương pháp kết tủa:
Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của hoạt chất sinh học, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử hoạt chất bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử hoạt chất sinh học sẽ tăng lên.
Kết tủa hoạt chất sinh học ở điểm đẳng điện: hoạt chất sinh học nếu là chất lưỡng cực. Mức độ hòa tan của hoạt chất sinh học phụ thuộc vào pH. Kết tủa hoạt chất sinh học ở điểm đẳng điện thường thực hiện ở quy mô nhỏ. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính hoạt chất sinh học.
Cô đặc dịch thủy phân chitin bởi chế phẩm chitinase được tiến hành ở áp suất chân không, nhiệt độ từ 40ºC đến 75ºC (tốt hơn chọn nhiệt độ từ 45ºC đến 55ºC) tới nồng độ chất khô (phần lớn là NAG) khoảng 30% đến 45% [96]. Cô đặc dịch NAG sau lọc dòng ngang ở áp suất chân không, nhiệt độ 50ºC [7]. Dịch nổi NAG được cô đặc còn 1/3 thể tích bằng hệ thống cô quay [10].
1.6.3. Kết tinh
Kết tinh là quá trình tách chất rắn hòa tan trong dung dịch dưới dạng tinh thể. Tinh thể là những vật rắn đồng nhất có các hình dạng khác nhau, giới hạn bởi các mặt phẳng.
Tinh thể gồm cả các phân tử nước gọi là tinh thể ngậm nước (tinh thể hydrat). Tùy theo điều kiện thực hiện quá trình mà tinh thể có thể ngậm số phân tử nước khác nhau.
Điều kiện cần thiết để có quá trình kết tinh là phải tạo cho được những dung dịch quá bão hòa, tức làm mất cân bằng pha của hệ. Do đó cần sử dụng các phương pháp: kết tinh tách một phần dung môi, kết tinh với thay đổi nhiệt độ, kết tinh chân không. Kết tinh thu phần tử rắn sạch gồm các giai đoạn:
Giai đoạn 1: Giai đoạn kết tinh bằng cách hạ nhiệt độ hay làm bay hơi một phần dung môi.
Giai đoạn 2: Tách tinh thể ra khỏi dung dịch còn lại bằng cách lắng, lọc, ly tâm.
Giai đoạn 3: Kết tinh lại (trong điều kiện cần thiết).
Giai đoạn 4: Rửa và sấy khô tinh thể.
Rohani (2010) đã công bố các ứng dụng quá trình kết tinh để bào chế (tinh sạch và thu nhận) các hoạt chất sinh học trong công nghệ dược [119].
Quá trình kết tinh được sử dụng trong tinh sạch và thu chế phẩm NAG từ dịch thủy phân chitin bởi chế phẩm chitinase [96, 132].
1.6.4. Tinh sạch NAG bằng dung môi
Những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu giải pháp tách tạp chất trong dung dịch NAG đã cô đặc được công bố bởi các nhà khoa học:
Hòa dung dịch NAG cô đặc vào dung môi như ethanol, methanol, acetone, tetrahydrofuran, dioxane và acetonitrile,... Do NAG không hòa tan trong dung dịch hỗn hợp nên dễ dàng loại được một phần tạp chất hòa tan vào dung môi này. Sau khi loại bỏ tạp chất, hạ nhiệt độ của hỗn hợp dung môi chứa NAG xuống thấp sẽ làm kết tinh các tinh thể NAG. Tiếp tục loại tạp chất bằng cách hòa tan tinh thể NAG nhận được với dung môi và tiến hành tách tạp chất lần nữa thu tinh thể rắn NAG. Sản phẩm NAG nhận được lần 2 có độ tinh sạch khoảng 70% đến 99% [96].
Aiba (2005) cho rằng lựa chọn tỷ lệ EtOH/ dịch NAG cô đặc 10/1 để rửa và kết tủa loại tạp chất thu NAG có độ tinh sạch trên 95% [7].
1.6.5. Qui trình tinh sạch để thu nhận NAG
Aiba (2005) thu nhận NAG theo qui trình: dịch thủy phân chứa NAG sau ly tâm loại chitin dư và tạp chất rắn, được thực hiện siêu lọc để loại enzym, rồi tiến hành cô đặc ở nhiệt độ 50o C ở áp suất chân không thu dịch NAG thô cô đặc; sau đó dịch NAG thô cô đặc được trộn với EtOH rồi để nhiệt độ 4o C và thu phần kết tủa rắn. Phần rắn kết tủa này được rửa bằng EtOH, rồi sấy khô thu sản phẩm NAG với độ tinh sạch trên 95% và hiệu suất thu hồi khoảng 43% [7].
Setthakaset và cs (2008) thực hiện thu nhận NAG: dịch thủy phân chứa NAG sau lọc loại tạp chất rắn, được loại màu bằng hoạt tính, rồi đưa cô đặc thu dịch NAG thô đã cô đặc;
sau đó dịch thủy phân NAG thô này (màu vàng sáng) được khuấy với EtOH trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ phòng, rồi lọc thu phần rắn màu trắng để sấy chân không thu sản phẩm NAG với độ tinh sạch trên 70% và hiệu suất thu hồi đạt 65% [132].
Ajavakom và cs (2012) phối trộn dung dịch EtOH vào dịch thủy phân chứa NAG đã cô đặc còn 1/3 thể tích, đồng thời khuấy liên tục tạo các đám mây lơ lửng và để kết lắng
4ºC qua đêm loại kết tủa tạp chất (phần lớn chitin dư) thu phần dịch nổi. Phần dịch nổi được loại màu bằng cách khuấy với than hoạt tính trong 45 phút, rồi được cô đặc bằng cô quay, sau đó sấy đông khô thu sản phẩm NAG với độ tinh sạch trên 95% và hiệu suất thu hồi đạt 65% [10].