3.1. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P. OXALICUM 20B
3.1.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase
Nghiên cứu động thái sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp chitinase của nấm mốc P. oxalicum 20B được tiến hành với các điều kiện thích hợp nhất đã lựa chọn. Trong quá trình lên men xác định lượng sinh khối (mục 2.2.1); hoạt độ chitinase, hoạt độ endochittinase, hoạt độ NAHase (mục 2.2.3) và pH dịch lên men. Kết quả biểu hiện trên Hình 3.7 và Bảng 3.1.
Kết quả Hình 3.7 cho thấy trong quá trình lên men pH giảm dần từ pH 6,67 xuống giá trị pH 5,50 và giữ ổn định tới khi kết thúc lên men. Sinh khối tăng nhanh chóng đạt cực đại sau khoảng 48 h lên men (0,75 g/l), sau đó giảm liên tục tới cuối quá trình lên men. Sự giảm sinh khối có thể được lý giải là do quá trình tự phân khiến cho pellet vỡ, hàm lượng sinh khối giảm. Khi hàm lượng đường trong môi trường đã cạn kiệt, cơ chất cảm ứng là chitin thô, thì chitinase được sinh tổng hợp để thủy phân chitin, đồng thời quá trình tự phân xảy ra khiến cho pellet vỡ, hàm lượng sinh khối giảm. Hoạt tính chitinase tăng lên đáng kể tại pha sinh trưởng cân bằng và đạt cao nhất khi cuối pha cân bằng. Hoạt tính chitinase bắt đầu tăng sau thời gian lên men 24 h và đạt cực đại 0,074 U/ml tại 120 h, sau đó giảm nhanh và còn 0,051 U/ml tại 144 h lên men (Hình 3.7). Tương tự Aeromonas sp. GJ-18 sinh tổng hợp chitinase cao nhất đạt 1,44 U/ml tại 120 h lên men, sau thời gian 120 h khả năng sinh tổng hợp chitinase giảm [73]. Pencillium sp. LYG 0704 bắt đầu sinh tổng hợp chitinase tại 24 h lên men và tiếp tục tăng dần cho đến khi đạt được hoạt tính cao nhất sau 72 h lên men [80].
Bên cạnh đó, Hà (2013) đã nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase của nấm P. citrinum nhận được hoạt độ chitinase cao nhất 0,071 U/ml sau 36 h lên men [4]. Tương tự Aspergillus awamori cho chitinase hoạt độ cao nhất tại thời điểm lên men 36 h. Nhưng nấm Aspergillus terreus cho hoạt tính chitinase cao ở thời điểm lên men 96 h [41],..
Hình 3.7. Động thái sinh tổng hợp chitinase
Bảng 3.1. Động thái sinh tổng hợp chitinase, endochitinase, NAHase trong quá trình lên men của chủng Penicillium oxalicum 20B
Thời gian lên men (h)
Chitinase (U/ml)
Endochitinase (U/ml)
NAHase (U/ml)
0 0 0 0
12 0 0 0,004
24 0,001 0,461 0,005
48 0,018 0,582 0,008
72 0,049 1,388 0,023
96 0,061 3,725 0,320
108 0,069 5,038 0,665
120 0,074 5,058 0,683
132 0,065 4,963 0,621
144 0,051 3,600 0,406
Kết quả Bảng 3.1 cho thấy song song hoạt tính chitinase bắt đầu tăng 24 h và đạt cực đại tại 120 h lên men, thì hoạt tính NAHase bắt đầu xuất hiện sau 12 h lên men nhưng khá thấp, và từ 24 h lên men trở đi mới xác định được hoạt tính endochitinase. Hoạt tính chitinase, endochitinase, NAHase tiếp tục tăng cho tới thời gian 120 h và đạt cực đại 0,074 U/ml, 5,058 U/ml, 0,683 U/ml tương ứng. Sau 120 h lên men, hoạt tính của cả 03 enzym
đều giảm. Ngoài ra Penicillium monoverticillium CFR 2, Aspergillus flavus CFR 10 và Fusarium oxysporum CFR 8 đều có khả năng sinh tổng hợp endo-chitinase và β-N- acetylhexosaminidase hoạt tính cao nhất tại 166 h lên men [147].
Kết hợp từ kết quả Hình 3.7 và Bảng 3.1, chúng tôi thấy hoạt tính chitinase, endochitinase, NAHase đều tăng lên mạnh ở pha sinh trưởng cân bằng và đạt cao nhất cuối pha cân bằng tại 120 h lên men. Tương tự với công bố của Cannon và cs (1994), hoạt tính NAHase ngoại bào của các chủng nấm sợi tăng lên đáng kể ở pha sinh trưởng cân bằng [25].
Theo Rodri´guez (1993), chitinase, glucanase đóng vai trò quan trọng trong quá trình tự phân của P. oxalicum vì thành phần cấu tạo nên thành tế bào P. oxalicum là chitin [117].
Penicillium oxalicum có khả năng sinh tổng hợp endochitinase [118] và NAHase [116].
Kết quả trong Bảng 3.1 cho thấy chủng P. oxalicum 20B có khả năng sinh tổng hợp NAHase và endochitinase, mà không sinh tổng hợp chitobiosidase. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng giống với kết quả endochitinase và NAHase đều đã được tìm thấy ở dịch tự phân của Penicillium oxalicum [118].
Như vậy P. oxalicum 20B sinh tổng hợp enzym có hoạt tính chitinase, endochitinase, NAHase cao nhất lần lượt 0,074 U/ml, 5,058 U/ml, 0,683 U/ml; không có hoạt tính chitobiosidase ở điều kiện lên men tối ưu (4 g/l chitin thô, 10 g/l cao nấm men và pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p, thời gian 120 h).
Sự kiểm định hoạt tính tại các thời điểm lấy mẫu dịch lên men được xác định bằng thủy phân gel chitin 50% (ở điều kiện pH 5, nhiệt độ 35ºC, tỷ lệ dịch lên men/ dịch gel chitin là 1/1) thành đường khử (Hình 3.8) cũng như thành NAG tăng tương ứng (Hình 3.9).
Hình 3.8. Khả năng thủy phân dịch gel chitin 50% thành đường khử bằng dịch lên men chứa chitinase lấy ở các thời điểm lên men khác nhau (dịch lên men pha loãng 02 lần)
Hình 3.9. Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin 50% bởi dịch lên men được pha loãng 2 lần trong điều kiện 35ºC, pH 5, thời gian 24 h. (1) NAG chuẩn nồng độ 20
mg/ml (dựng 2,5 àl); (2) Đối chứng; (3), (4), (5), (6), (7), (8) tương ứng thời gian lấy mẫu dịch lờn men 72 h; 96 h; 108 h; 120 h; 132 h; 144 h (dựng 2,5 àl).
Như vậy dịch lên men tại thời điểm từ 108 h đến 132 h có khả năng thủy phân cao 50% gel chitin. Cụ thể lượng đường khử tạo thành 12,489 mg/ml, 12,656 mg/ml và 12, 074 mg/ml tại thời điểm lên men sinh tổng hợp 108 h, 120 h và 132 h tương ứng.
Trên cơ sở đó chúng tôi lựa chọn điều kiện pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p, 4 g/l chitin thô, 10 g/l cao nấm men và thời gian lên men 120 h để sinh tổng hợp enzym từ P. oxalicum 20B cho nghiên cứu tiếp theo.