3.2. NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT
3.2.4. Xác định đặc tính sinh học của chế phẩm chitinase kỹ thuật
Chế phẩm chitinase kỹ thuật có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 2,152 U/ml HAHase và 12,695 U/ml endochitinase nhận được sau khi cô đặc 4 lần trên màng được đem đi xác định đặc tính.
3.2.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzym của chế phẩm được xem xét qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym theo phương pháp mục 2.3.3, ta có kết quả thể hiện trên Hình 3.12.
0 50 100
0 1 2 3 4 5
Hoạt tính NAHase tƣơng đối (%)
Thời gian (ngày) 0
20 40 60 80 100
30 35 40 45 50
Hoạt độ chitinase tƣơng đối (%)
Nhiệt độ ( C)
0 20 40 60 80 100
0 1 2 3 4 5
Hoạttínhchitinase tƣơng đối (%)
Thời gian (ngày)
0 20 40 60 80 100
30 35 40 45 50
Hoạt độ Endochitinase tƣơng đối (%)
Nhiệt độ (0C)
0 50 100
30 35 40 45 50
Hoạt độ NAHase tƣơng đối (%)
Nhiệt độ (0C) A
C
E
B
D
F 0 20 40 60 80 100
0 1 2 3 4 5
Hoạt tính Endochitinase tƣơng đối (%)
Thời gian (ngày)
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) của chế phẩm enzym kỹ thuật. Sự giảm
hoạt độ enzym tại 30ºC (); 35ºC (); 40ºC (), 45ºC () và 50ºC ().
Kết quả Hình 3.12 A cho thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho xúc tác của chitinase là 35ºC - 40ºC và tối ưu ở 40ºC. Ở 35ºC, hoạt tính chitinase chỉ thấp hơn khoảng 10% so với 40 C. Đặc biệt ở nhiệt độ trên 40ºC hoạt tính chitinase giảm mạnh, cụ thể ở 45ºC hoạt tính chitinase giảm khoảng 30% và ở 50ºC hoạt tính giảm 70%. Nhiệt độ tối ưu 40ºC cũng được tìm thấy ở chitinase từ chủng Penicillium sp. LYG 0704 [80] và chủng Aspergillus
carneus [109]. Tuy nhiên, chitinase từ một số chủng nấm sợi khác lại có nhiệt độ tối ưu cao hơn 500C với chủng P. aculeatum [20] và 55ºC với chủng A. protuberus [48].
Kết quả trên Hình 3.12 C và Hình 3.12 E cho thấy cả endochitinase và NAHase đều có khoảng nhiệt độ thích hợp là 35ºC - 40ºC. Tuy nhiên, endochitinase vẫn thể hiện hoạt tính tốt ở nhiệt độ thấp hơn (ở 30ºC hoạt tính chỉ giảm 20%), ngược lại NAHase lại thể hiện khả năng chịu nhiệt tốt hơn (ở 45ºC hoạt tính chỉ giảm 10%). Ở nhiệt độ cao 50ºC, hoạt tính cả endochitinase và NAHase giảm mạnh, đặc biệt với endochitinase dẫn đến hoạt tính chitinase giảm tới 76%.
Đánh giá độ bền hoạt lực của enzym với nhiệt độ, chế phẩm enzym được giữ ở môi trường pH 5 và nhiệt độ khác nhau từ 30 - 50ºC trong 5 ngày. Sau đó, xác định hoạt độ enzym và kết quả biểu diễn trên Hình 3.12 B, Hình 3.12 D, Hình 3.12 F.
Kết quả cho thấy chế phẩm chitinase không bền nhiệt. Cụ thể ở nhiệt độ 45ºC và 50ºC chỉ sau 2 ngày, hoạt độ của NAHase vẫn còn khá cao lần lượt 71% và 57%, nhưng hoạt độ của endochitinase giảm về không và hoạt độ chitinase tổng không tìm thấy. Điều này cho thấy vai trò của endochitinase rất quan trọng tạo cơ chất đặc hiệu cho NAHase xúc tác thủy phân.
Ở nhiệt độ 40ºC tối ưu cho hoạt tính chitinase, hoạt độ chitinase chỉ còn lại khoảng 20% sau 5 ngày. Do vậy để ứng dụng chế phẩm cho thủy phân chitin không nên kéo dài quá 3 ngày.
Theo Rodriguez và cs, endochitinase và NAHase tinh sạch từ P. oxalicum có nhiệt độ tối ưu tương ứng là 35ºC và 40ºC [116, 117] tương tự kết quả trong nghiên cứu này.
Ngoài ra Rodriguez và cs (1995) khẳng định hoạt tính chitinase tinh sạch từ P. oxalicum chỉ cũn ẵ trong thời gian lần lượt 53 phỳt và 23 phỳt tương ứng ở nhiệt độ 45ºC và 50ºC khi pH 5 [116]. Nhưng hoạt tính chitinase của chế phẩm enzym kỹ thuật từ P. oxalicum 20B vẫn còn 60% và 10% trong thời gian tới 24 h tương ứng ở nhiệt độ 45ºC và 50ºC khi pH 5 (Hình 3.12 B) thể hiện tính ưu việt của chế phẩm kỹ thuật so với enzym tinh sạch
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền chitinase, endochitinase và NAHase trong chế phẩm enzym kỹ thuật một lần nữa khẳng định endochitinase kém bền nhiệt hơn NAHase. Hơn nữa tác dụng tương hỗ endochitinase và NAHase sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase thu nhận được.
3.2.4.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzym
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzym của chế phẩm enzym kỹ thuật được xem xét qua hoạt lực xúc tác và độ bền hoạt lực enzym theo phương pháp mục 2.3.3, ta có kết quả thể hiện trên Hình 3.13.
0 20 40 60 80 100
3 4 5 6 7 8
Hoạt độ chitinase tƣơng đối (%)
pH
0 20 40 60 80 100
0 1 2 3 4 5
Độ bền tƣơng đối chitinase (%)
Thời gian (ngày)
0 20 40 60 80 100
3 4 5 6 7 8
Hoạt độ Endochitinase tƣơng đối (%)
pH
0 20 40 60 80 100
3 4 5 6 7 8
Hoạt độ NAHase tƣơng đối (%)
pH
0 20 40 60 80 100
0 1 2 3 4 5
Hoạt tính Endochitinase tƣơng đối (%)
Thời gian (ngày)
50 75 100
0 1 2 3 4 5
HoạttínhNAHase tƣơng đối (%)
Thời gian (ngày)
A B
D C
E F
Hình 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) và tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) của chế phẩm enzym kỹ thuật. Sự giảm
hoạt độ enzym ở pH 3 (), pH 4 (), pH 5 (), pH 6 (), pH 7 ().
Kết quả Hình 3.13 cho thấy pH ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt độ và độ bền của chitinase, endochitinase, NAHase từ P. oxalicum 20B. pH tối ưu cho xúc tác của chitinase, endochitinase, NAHase lần lượt là pH 5, pH 4, trong khoảng pH 5 - pH 6. Chitinase có khoảng giá trị pH thích hợp nằm trong vùng axit, hoạt tính enzym thấp hơn chút ít tại pH 6, nhưng rất thấp ở pH 7 và pH 8 (hoạt tính giảm 40%, thậm chí tới 50%) (Hình 3.13 A).
Endochitinase thể hiện rõ hơn là một enzym axit, ở pH 3, hoạt tính enzym chỉ giảm gần 20%, trong khi đó ở pH lớn hơn 7 enzym không còn khả năng xúc tác nữa (Hình 3.13 C).
Khác với 02 loại enzym trên NAHase tương đối bền với sự thay đổi của pH, với giá trị pH rất thấp (pH 3) và pH cao (pH 8) hoạt tính NAHase chỉ giảm không đáng kể (< 10%) (Hình 3.13 E).
Khác chút ít với kết quả nghiên cứu của chúng tôi, Rodriguez và cs (1993) đã chứng minh chitinase, endochitinase tinh sạch, NAHase tinh sạch từ P. oxalicum có hoạt tính tối ưu lần lượt pH ở khoảng 5 - 6, pH 5 và pH ở khoảng 4 - 5 [117]. NAHase từ P. oxalicum có hoạt tính ổn định trong khoảng pH từ 6,5 - 7,5 [118]. Souza và cs (2003) đã công bố endochitinase tinh sạch từ Colletotrichum gloeosporioides hoạt động tối ưu ở pH 7 [142].
Đánh giá độ bền hoạt lực của enzym với pH, chế phẩm enzym được giữ ở môi trường nhiệt độ 35ºC và pH khác nhau từ 3 - 7 trong 5 ngày. Sau đó, xác định hoạt độ enzym và kết quả biểu diễn trên Hình 3.13 B, Hình 3.13 D, Hình 3.13 F.
Khoảng giá trị pH 5 - pH 6 tối ưu cho độ bền hoạt lực và hoạt tính xúc tác của chitinase. Tuy nhiên, pH thấp làm giảm hoạt tính chitinase mạnh mẽ hơn pH cao. Sau 4 ngày, hoạt tính chitinase đã bị mất hoàn toàn tại pH 3 và hoạt tính còn 19% khi pH 7. Đối với endochitinase, vùng axit yếu vẫn thể hiện ảnh hưởng tốt tới độ bền hoạt lực enzym, bền nhất tại pH 5, kém bền hơn một ít ở pH 4 và pH 3 và hoạt tính endochitinase mất hoàn toàn sau 4 ngày ở pH 6 và sau 1 ngày tại pH 7. Hoạt tính NAHase thể hiện khá bền theo thời gian trong khoảng pH 3 đến pH 7. Sau 05 ngày hoạt tính NAHase giảm không đáng kể. Cụ thể ở pH 6 hoạt tính tương đối đạt 96% và thấp nhất ở pH 3 hoạt tính còn lại 88%.
Kết quả trên có sự tương đồng so với các nghiên cứu đã công bố như: Lee và cs (2009) cho rằng chitinase từ Penicillium sp. LYG 0704 có hoạt tính tối ưu ở pH 5,0 và nhiệt độ 40ºC [80]. Bên cạnh đó, Rodriguez và cs (1995) công bố NAHase tinh sạch từ dịch tự phân P. oxalicum có hoạt tính tối ưu ở pH 5,0 và nhiệt độ 35ºC, enzym này bền vững ở nhiệt độ tối đa 45ºC khi pH giao động từ 4,0 đến 6,0 trong thời gian 2 h [116].
Rodriguez và cs (1993) nhận thấy NAHase từ P. oxalicum bền trong khoảng pH 3 - 7 [117];
NAHase tinh sạch từ P. oxalicum ổn định ở pH 4 - 6 trong thời gian 2 h, tuy nhiên bị vô hoạt nhanh chóng khi pH thấp hơn 4 hoặc lớn hơn 7 [116], nhưng hoạt tính endochitinase chỉ cũn ẵ ở 450C khi pH 4 trong thời gian 15 phỳt [118]. Khỏc với kết quả nghiờn cứu của chúng tôi, Rodriguez và cs (1993) đã chứng minh endochitinase tinh sạch từ P. oxalicum bền trong khoảng pH 4 - 8 [117].
Kết quả Hình 3.12 và Hình 3.13 chỉ ra pH 5 là pH tối ưu cho hoạt độ xúc tác của chitinase trong chế phẩm kỹ thuật, tuy nhiên khoảng pH 5 - pH 6 tối ưu cho hoạt động NAHase nhưng pH 4 tối ưu cho hoạt động endochitinase. Nhiệt độ thích hợp nhất cho cả 03 enzym đều là 40ºC. NAHase bền pH và bền nhiệt hơn chitinase và endochitinase. Cụ thể: Ở nhiệt độ 35ºC và thời gian 1 ngày, hoạt tính NAHase, chitinase và endochitinase bền nhất lần lượt tại pH 6 (vẫn còn 100% hoạt tính), pH 5 (còn 86% hoạt tính) và pH 5 (còn 73% hoạt tính). Nhưng ở thời gian 5 ngày, hoạt tính NAHase, chitinase và endochitinase bền nhất lần lượt tại pH 6 (còn 96% hoạt tính), pH 5 (chỉ còn 39% hoạt tính) và pH 5 (chỉ còn 2% hoạt tính).