2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu thủy phân chitin
* Phương pháp xử lý vật lý:
Xử lý nhiệt và áp suất:
Tất cả các mẫu nguyên liệu chứa chitin pha trong đệm natri acetate (0,1 M; pH 5) để xử lý nhiệt và áp suất. Mô tả phương pháp xử lý ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Xử lý nhiệt, áp suất lên nguyên liệu chitin Phương pháp xử lý Thời gian xử lý
100ºC (nước sôi) 20 phút, 40 phút 121ºC / P = 1atm (nồi hấp) 20 phút
150ºC / P = 3,7 atm 20 phút
Vi sóng 60 giây, 90 giây, 120 giây Xử lý nghiền:
Xử lý chitin mũ ni bằng thiết bị nghiền bi được các phân đoạn Bảng 2.4 Bảng 2.4. Các phân đoạn kích thước nguyên liệu chitin
Xử lý siêu âm:
Các phân đoạn chitin mũ ni sau nghiền được đưa vào dung dịch đệm natri acetate (0,1 M pH 5) lượng chitin với dịch đệm là 0,005 g/ml, sau đó siêu âm 50/60 Hz ở nhiệt độ ban đầu 40ºC theo các phương thức sau:
+ Siêu âm trong 60 phút, sau đó cho chế phẩm enzym (hoạt độ chitinase 27,051 mU/ml) vào và tiến hành thủy phân chitin.
+ Bổ sung chế phẩm enzym (hoạt độ chitinase 27,051 mU/ml) vào trước khi siêu âm với chế độ siêu âm 60 phút, hoặc siêu âm gián đoạn 03 lần, mỗi lần 20 phút.
* Phương pháp xử lý hóa học:
Xử lý hóa học chitin thô và chitin qua nghiền:
Nguyên liệu được bổ sung chất hoạt động bề mặt Triton – X 100 nồng độ 1%, 2%
hay Urea 1 M, 2 M khuấy trộn bằng máy khuấy từ ở 100ºC trong 60 phút hoặc bằng dung dịch chứa 0,1% H2SO4 và đưa vào nồi hấp ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1 atm trong 20 phút hoặc siêu âm 60 phút. Sau khi xử lý, lọc và rửa nguyên liệu bằng nước cất loại bỏ hóa chất để chuẩn bị thủy phân.
Xử lý chitin dạng thô thành dạng gel:
Hòa tan 5 g chitin dạng thô trong 100 ml HCl 37% lạnh, khuấy đều trong thời gian 18 h ở nhiệt độ 4ºC. Sau đó bổ sung 500ml EtOH lạnh 96% và tiếp tục khuấy tại 4ºC trong 24 h để kết tủa chitin. Chitin keo được rửa bằng nước cất đến pH 5 và thu gom nhờ ly tâm ở 4ºC, 6000 v/p trong 10 phút [80]. Từ 1 g chitin thu được 18 g gel chitin.
Xử lý hóa học trên nguyên liệu gel chitin:
+ Pha Urea thành các nồng độ 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M trong dung dịch đệm natri acetate (0,1 M; pH 5) sau đó tiến hành bổ sung gel vào dung dịch vừa pha và thực hiện thủy phân.
Chitin mũ ni
MN > 2 mm 600 àm < MN < 2 mm 425 àm < MN < 600 àm 215 àm < MN < 300 àm
MN < 63 àm
+ Xử lý gel chitin với hóa chất Triton X-100 nồng độ 1%; 2% và Urea nồng độ 1 M;
2 M tương tự như với chitin MN thô và qua nghiền.
* Hiệu quả tiền xử lý chitin được đánh giá thông qua phương pháp SEM, DSC, FTIR, và thông qua giá trị hiệu suất thủy phân (HSTP) tương đối, HSTP chitin thành (NAG)i (với i từ 1 đến 3).
+ Cách xác định HSTP tương đối:
Phản ứng enzym và cơ chất theo tỷ lệ 1:1 (v/v) ở 40ºC. Sau phản ứng, tiến hành ly tâm lạnh ở 6000 vòng/phút trong 10 phút thu dịch thủy phân và xác định lượng NAG tạo thành theo DNS.
Công thức tính HSTP tương đối:
(2.9)
Trong đó:
H: hiệu suất thủy phân tương đối (%);
M1: lượng NAG tạo thành trong dịch thủy phân (mg/ml) được xác định bằng phương pháp DNS (mg);
M2: khối lượng chitin tính theo % chitin trong nguyên liệu (mg);
0,92: hệ số chuyển đổi chitin thành NAG theo lý thuyết.
+ Cách xác định HSTP chitin thành (NAG)i: - Cách tính HSTP chitin ra NAG:
YNAG/ Chitin = mNAG*0,92*100
mChitin (%) (2.10)
Trong đó:
YNAG/Chitin: hiệu suất thủy phân (%);
mNAG: lượng NAG trong dịch thủy phân (mg/ml) được xác định bằng HPLC;
mChitin: lượng chitin trong mẫu (g);
0,92: hệ số chuyển đổi chitin thành NAG.
- Cách tính hiệu suất thủy phân chitin ra (NAG)2 và (NAG)3
Y (2.11)
Trong đó:
Y(NAG)i/Chitin(%): Hiệu suất thủy phân chitin ra (NAG)i;
m(NAG)i: lượng (NAG)i trong dịch thủy phân (mg/ml) được xác định bằng HPLC;
mChitin: lượng chitin trong mẫu (g) với i là 2 - 3.
2.3.5.2. Phương pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân chitin
Sử dụng gel chitin làm cơ chất để khảo sát điều kiện phản ứng thủy phân bởi chế phẩm enzym kỹ thuật; tỷ lệ dịch enzym: dịch gel chitin là 1:1 (v/v). Phản ứng thủy phân được kết thúc bằng cách đun sôi trong 15 phút. Lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng tại các thời điểm lấy mẫu được xác định bằng phương pháp DNS.
* Nhiệt độ tối ưu cho phản ứng được xác định thông qua lượng đường khử tạo thành trong phản ứng giữa enzym kỹ thuật (hoạt độ 7,051 mU/ml) và dịch gel chitin 25% (v/v) ở dải nhiệt độ 30 - 45ºC và pH 5.
* pH tối ưu cho phản ứng được xác định thông qua lượng đường khử tạo thành trong phản ứng giữa enzym kỹ thuật (hoạt độ 7,051 mU/ml) và dịch gel chitin 25% (v/v) ở nhiệt độ tối ưu và trong dải pH 3 - 8.
* Nồng độ chitin ảnh hưởng lên quá trình thủy phân gel chitin được đánh giá thông qua lượng đường khử tạo thành giữa phản ứng enzym kỹ thuật (hoạt độ 3,867 mU/ml) và dịch cơ chất nồng độ gel chitin từ 20 - 40% (v/v) (tương ứng 200 - 416 mg/ml) ở nhiệt độ và pH tối ưu.
* Nồng độ enzym ảnh hưởng lên quá trình thủy phân gel chitin được đánh giá thông qua lượng đường khử tạo thành khi phản ứng giữa dịch enzym kỹ thuật hoạt độ từ 1,365 - 22,405 mU/ml và dịch cơ chất 40% gel chitin (v/v) ở nhiệt độ và pH tối ưu.