2.2.1. Phương pháp xác định sinh khối nấm mốc
Cách tiến hành: Lấy 100 ml canh trường đã lên men để ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút loại dịch và thu sợi nấm. Sợi nấm được rửa sạch và sấy nhiệt độ 105ºC đến khối lượng không đổi.
Sinh khối nấm mốc được biểu diễn bằng số gam trọng lượng khô của sợi nấm trong mỗi lít canh trường.
2.2.2. Phương pháp phân tích hóa lý 2.2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm
* Độ ẩm của các mảnh chitin được xác định bằng phương pháp sấy ở 105oC đến khối
lượng không đổi theo TCVN 3700:1990 đối với sản phẩm thủy sản khô.
* Độ ẩm của chế phẩm bột NAG được xác định bằng phương pháp sấy hồng ngoại.
2.2.2.2. Phương pháp định lượng (NAG)i
A). Phương pháp DNS.
Theo phương pháp DNS [95] coi lượng đường khử tạo thành là NAG.
- Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) trong môi trường kiềm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:
Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid (Màu vàng) (Màu đỏ da cam)
* Cách tiến hành: Dịch sau thủy phân được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 15 phút. Lấy 0,5 ml dịch nổi cùng với 1ml dung dịch DNS và lắc đều. Hỗn hợp đó được đun sôi trong 5 phút và sau đó được làm lạnh nhanh tới nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang phản ứng ở bước sóng 540 nm. Dùng NAG làm chất chuẩn để xây dựng đường chuẩn NAG ở phụ lục 3.
Công thức tính:
(mg/ml) (2.1)
Trong đó: X: lượng NAG (mg/ml); A và A0: độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm và mẫu vô hoạt enzym ở cùng một thời điểm xác định; n: hệ số pha loãng mẫu; kNAG , b:
lần lượt là hệ số góc và hệ số tự do của đường chuẩn NAG.
B). Phương pháp HPLC
Lượng (NAG)i, với i từ 1 – 3 được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): thiết bị Agilent 1200 infinity, áp suất bơm Pmax = 100 bar, cột Aminex HPX-87H tách rửa ở nhiệt độ 40oC, pha động H2SO4 10 mM, vận tốc dòng v = 0,6 ml/
phút, thể tích tiêm mẫu 0,02 ml, phát hiện UV ở 210 nm. Từ sắc ký đồ (NAG)i chuẩn, ta có lượng (NAG)i với i = 1-3.
C). Phổ sản phẩm thủy phân được xác định bởi phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
Cách tiến hành: Dịch sau thủy phân được chấm trên bản silica gel (Kieselgel 60 F245 Merck), sử dụng n-propanol 99%: amoniac 27% theo tỷ lệ 2:1 (v/v) làm dung môi phân tách. Sản phẩm thủy phân được quan sát trên bản sắc ký sau khi phun bản sắc ký bằng dung dịch 5% H2SO4 pha trong EtOH tuyệt đối và sấy ở nhiệt độ 140ºC trong 30 phút.
2.2.2.3. Phương pháp xác định Nitơ tổng số của mẫu chitin
Hàm lượng Nitơ tổng số của mẫu chitin được xác định bằng phương pháp Kjeldahl.
2.2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein của mẫu chitin
Hàm lượng protein trong nguyên liệu chứa chitin được xác định bằng phương pháp Biuret:
Dựng đường chuẩn protein: Hòa tan dung dịch Albumin nguyên chất với nước cất sẽ được một dung dịch protein có nồng độ 10 mg/ml. Đường chuẩn được xác định trong khoảng nồng độ 0 - 0,8 mg/ml được pha từ dung dịch mẹ vừa pha. Lấy 1 ml dung dịch protein các nồng độ vừa pha vào ống nghiệm rồi bổ sung 4 ml thuốc thử Biuret, lắc đều và để phản ứng 30 phút. Sau đó giá trị màu dung dịch hấp thụ được đem so màu ở bước sóng 570 nm (Phụ lục 4).
Phương pháp chuẩn bị mẫu và đo mẫu: Cân 1 g nguyên liệu chứa chitin cho vào ống fancol. Sau đó giữ ở bình ổn nhiệt 90ºC trong 1 h, tiếp tục làm nguội xuống nhiệt độ phòng rồi lọc thu dịch trong. Protein nằm trong phần dịch này, dịch lọc đưa đi ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút để đảm bảo loại bỏ hết phần cặn kết tủa. Pha loãng dịch ly tâm tới nồng độ sao cho tiến hành phản ứng màu giá trị đo được nằm trong đường chuẩn. Sau khi pha loãng lấy 1 ml dung dịch đã pha loãng cộng với 4 ml dung dịch màu Biuret, để phản ứng trong 30 phút. Cuối cùng đo giá trị màu bằng máy đo quang ở bước sóng 570 nm.
2.2.2.5. Cách tính hàm lượng chitin
Hàm lượng chitin trong nguyên liệu được xác định theo phương pháp Black M.M (1950) bằng cách nhân hệ số 14,5 với Nitơ chitin (giả thiết chitin tinh khiết chứa 6,9%
nitơ) [21] nên có công thức tính:
Cchitin = (Cnitơ tổng – Cnitơ hữu cơ) x (14,5)
(2.2) Trong đó:
Cnitơ tổng: Hàm lượng nitơ tổng số được xác định theo phương pháp Kjeldahl (%);
Cnitơ hữu cơ (%) = PBiuret / 6,25; Cnitơ hữu cơ: hàm lượng nitơ hữu cơ (%); Pbiuret: hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Biuret (%); 6,25: hệ số chuyển đổi giữa nitơ và protein; 14,5: hệ số chuyển đổi % nitơ sang % chitin.
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzym
2.2.3.1. Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp Binod cải tiến
Cách tiến hành: Phương pháp Binod cải tiến [19] như sau: Dịch enzym trộn với dịch gel chitin 1% pH 5 theo tỉ lệ 1:1 (v/v) được ủ trong thời gian 20 phút ở nhiệt độ 35ºC. Xác định lượng đường khử tạo thành bằng phương pháp DNS. Một đơn vị hoạt độ chitinase được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để thủy phõn gel chitin tạo thành 1 àmol NAG trong 1 phút.
Công thức tính:
Hoạt độ chitinase = (U/ml)
(2.3)
Trong đó: M: lượng NAG tạo thành (microgam); 221,21: khối lượng phân tử của NAG; n: hệ số pha loãng enzym; 20: thời gian thủy phân (phút); 2: thể tích phản ứng (ml).
2.2.3.2. Hoạt độ endochitinase được xác định theo phương pháp Yabuki cải tiến
Cách tiến hành: Phương pháp Yabuki cải tiến [179] như sau: Trộn 2 ml dịch enzym với 320 àl gel chitin 20% và 1680 àl dung dịch đệm acetate natri 0,1 M, pH 5 và ủ trong thời gian 20 phút, ở 35ºC. Đo độ hấp phụ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 610 nm trước và sau khi ủ. Nồng độ enzym cần được pha loãng ở ngưỡng sao cho sự giảm độ hấp phụ quang không quá 20%. Một đơn vị hoạt độ enzym được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để làm giảm 1% độ hấp phụ quang ở bước sóng 610 nm trong 1 phút.
Công thức tính hoạt độ endochitinase:
(U/ml)
(2.4)
Trong đó:
A0 và A: độ hấp phụ quang của hỗn hợp phản ứng tại thời điểm trước ủ (0 phút) và sau ủ (20 phút);
4: thể tích dịch phản ứng (ml);
n: hệ số pha loãng enzym;
2: thể tích enzym (ml);
20: thời gian phản ứng (phút);
2.2.3.3. Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase
Hoạt độ NAHase được xác định dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-nitrophenyl N-
axetyl-β-D glucosaminidase (pNP-NAG) giải phóng p – nitrophenol hấp phụ màu ở bước sóng 400 nm [92].
Cỏch tiến hành: Ủ 20 àL dịch enzym cựng 230 àL dịch 10 mM pNP-NAG pha với đệm citrate phosphate 50 mM pH 6 trong thời gian 10 phút, ở 35ºC. Kết thúc phản ứng bằng cỏch thờm 750 àL Na2CO3 0,4M. Đo độ hấp phụ quang của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 400 nm. Một đơn vị hoạt độ enzym được định nghĩa là lượng enzym cần thiết để giải phúng 1àmol p-nitrophenol trong 1 phỳt ở điều kiện trờn [11].
Công thức tính hoạt độ NAHase:
0 pNP-NAG
1, 25 ( / )
A A
n U ml k
(2.5)
Trong đó:
A, A0: độ hấp thụ quang của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng;
kpNP: hệ số góc của đường chuẩn pNP – NAG được xây dựng ở phụ lục 5;
n: hệ số pha loãng enzym;
2.2.3.4. Hoạt độ chitobiosidase
Hoạt độ 1,4- -chitobiosidase được xác định như phương pháp xác định hoạt độ NAHase, nhưng cơ chất pNP-(NAG)1 được thay thế bằng p-nitrophenyl N,N′-diacetyl-β- D-chitobioside (pNP-(NAG)2).
2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc bề mặt của chitin, NAG
Cấu trúc bề mặt chitin (hoặc NAG) được xác định bằng phân tích vi điện tử quét (SEM) trên máy HITACHI-S4800 tại Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương - 131 Lò Đúc - Hai Bà Trưng - Hà Nội.
2.2.5. Phương pháp xác định đặc tính vật lý của chitin, NAG
Bằng phương pháp phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry (DSC)) [170] kiểm soát sự thay đổi đặc tính vật lý (nhiệt độ nóng chảy, điểm chuyển nhiệt độ) trong polymer sinh học (chitin) cũng như NAG.
Thực hiện đo nhiệt lượng quét trong mô đun 910 – DSC cùng với bộ phân tích nhiệt 2100 – TGA (đều từ USA) trên thiết bị Labsys Evo của Viện vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đường cong DSC được thực hiện trong điều kiện không khí bình thường. Các mẫu sau khi cân trọng lượng chính xác (± 0,1 mg) được đặt trong hộp
( )
1 1 20 230
1, 25
(min) 10 20
enzyme pNP NAG
reaction enzyme
V V
t V
nhôm cùng lỗ pin trung tâm. Dùng thanh kim loại Indi (99,99%) để định cỡ mô đun DSC liên quan tới nhiệt độ và enthalpy. Hộp nhôm không chứa mẫu được dùng để đối chứng và các dòng được thực hiện bằng gia nhiệt mẫu từ 20ºC lên đến 110ºC cùng đẳng nhiệt trong 15 phút. Mẫu sau khi cân được gia nhiệt từ nhiệt độ 20ºC đến 850ºC.
2.2.6. Phương pháp xác định cấu trúc của chitin, NAG
Cấu trúc chitin và cấu trúc NAG được xác định bằng phương pháp phân tích quang phổ hồng ngoại (FTIR) trong khoảng số sóng từ 400 - 4000 cm-1 [141] trên Perkin Elmer Spectrum100 FTIR spectrometer tại Viện Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.7. Phương pháp xác định sai số trung bình
Kết quả phân tích (Hoạt độ chitinase, hiệu suất thủy phân tương đối ra NAG,..) được xác định sai số trung bình theo độ lệch chuẩn, phần mềm excel 2007.