3.3. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN
3.3.2. Lựa chọn phương pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni
3.3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng mức độ nghiền đến khả năng thủy phân chitin
Chitin từ phế liệu tôm mũ ni được nghiền máy nghiền bi, sau đó được phân loại theo kớch thước cỏc phõn tử bằng hệ rõy (kớch thước lỗ rõy từ 63 àm đến 600 àm) và xỏc định trọng lượng và hàm lượng chitin trong từng phân đoạn. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng mức độ nghiền bi tới tính chất các phân đoạn bột nghiền Kích thước các phân đoạn của
bột nghiền
Tỷ lệ các phân đoạn (%)
Hàm lƣợng chitin (% CK)
Chitin tôm mũ ni trước khi nghiền 100 68,41
600 àm < MN 32,94 68,70
425 àm < MN < 600 àm 10,06 69,00
215 àm < MN < 425 àm 34,01 69,20
MN < 63 àm 22,99 69,31
Kết quả Bảng 3.6 cho thấy hàm lượng chitin trong các phân đoạn không khác nhau.
Điều này thể hiện chitin phân bố gần như đồng đều trong phế liệu chitin tôm MN.
Hình 3.15. Ảnh hưởng kích thước các phần tử chitin MN sau nghiền tới đường khử tạo thành
Xét ảnh hưởng của mức độ nghiền tới khả năng thủy phân chitin, ta thấy lượng đường khử nhận được tăng tỷ lệ thuận với mức độ nghiền (Hình 3.15). Lượng đường khử tạo thành lớn nhất sau 120 h thủy phõn với phõn đoạn bột nghiền nhỏ nhất (< 63 àm) là 1,392 mg/ml. Như vậy mức độ nghiền bi càng cao, càng giúp giảm kích thước [101] và làm giảm độ kết tinh chitin [98] trong nguyên liệu tạo điều kiện cho enzym tiếp xúc mạnh với cơ chất. Do đó nghiền bi chitin cho kích thước càng bé thì hiệu quả thủy phân chitin càng cao.
3.3.2.2. Ảnh hưởng xử lý phối hợp nghiền bi và siêu âm tới khả năng thủy phân chitin
Các phân đoạn bột chitin tôm mũ ni nhận được sau khi nghiền bi được đưa vào siêu
âm trong thời gian 60 phút, tiếp theo bổ sung chế phẩm enzym kỹ thuật. Sau đó tiến hành thủy phân chitin ở nhiệt độ 40ºC, lấy mẫu xác định lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân.
0.000 0.300 0.600 0.900 1.200 1.500
72h 96h 120h
Đường khử (mg/ml)
Thời gian thủy phân
600àm<MN<2mm+SA60' 425àm<MN<600àm+SA60' MN<63àm+SA60'
Hình 3.16. Ảnh hưởng xử lý siêu âm chitin MN sau nghiền bi tới đường khử tạo thành.
Kết quả nhận được trên Hình 3.15 và Hình 3.16 cho thấy nghiền bi phối hợp với siêu âm cải thiện rõ rệt HSTP ở tất cả các phân đoạn kích thước bột nghiền khác nhau. Thật vậy, sau 120 h thủy phân, lượng đường khử nhận được cao nhất với phân đoạn < 63 là 1,459 mg/ml có kết hợp siêu âm 60 phút cao hơn hẳn 1,329 mg/ml khi chỉ nghiền bi.
Kết quả này cũng được minh chứng bởi chụp SEM (Hình 3.19). Ảnh chụp SEM phân đoạn 425 μm < MN < 600 μm cho thấy sóng siêu âm có tác dụng đáng kể trong việc phá liên kết sâu hơn vào bên trong nguyên liệu tạo nên các phần tử có kích thước nhỏ hơn so với trước khi siêu âm (Hình 3.19 D).
Với kết quả khả quan của xử lý siêu âm bột nghiền tới khả năng thủy phân chitin, chúng tôi nghiên cứu lựa chọn giải pháp siêu âm thích hợp nhất. Trong phần nghiên cứu này chúng tôi tiến hành siêu âm gián đoạn các phân đoạn bột nghiền có kích thước khác nhau và enzym được bổ sung vào trước hoặc sau khi siêu âm. Sau 120 h thủy phân, xác định đường khử tạo thành và thể hiện kết quả trên Hình 3.17.
Kết quả nhận được cho thấy xử lý siêu âm không hề cải thiện khả năng thủy phân chitin với phân đoạn bột nghiền kích thước lớn (> 600 μm). Tác dụng tích cực chỉ thể hiện ở các phân đoạn có kích thước nhỏ (< 600 μm). Guadalupe và cs (2013) cũng nhận được hiệu quả thủy phân cao hơn hẳn khi siêu âm chitin trong 20 phút so với nguyên liệu không được xử lý khi thực hiện thủy phân bằng chitinase từ Lecanicillium lecanii [43].
Bổ sung enzym trước khi siêu âm cho lượng đường khử nhận được cao hơn (1,236;
1,497 mg/ml so với 1,213; 1,459 mg/ml). Điều này có thể được giải thích dựa trên cơ chế tác dụng của của sóng siêu âm tạo nhiều lỗ hổng (lỗ trống), đồng thời phá vỡ một phần liên kết hydro bên trong nguyên liệu. Các lỗ hổng tạo ra được choán đầy bởi chất lỏng dịch chuyển với sự dao động liên tục tạo hiện tượng vỡ bọt tạo điều kiện cho enzym dễ xâm nhập sâu để tiếp xúc với cơ chất. Đặc biệt khi siêu âm có mặt cả enzym sẽ giúp enzym đi
vào sâu hơn bên trong nguyên liệu, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzym và chitin đẩy nhanh quá trình thủy phân, rút ngắn thời gian thủy phân hơn so với phương pháp chỉ siêu âm nguyên liệu mà không có mặt enzym.
Hình 3.17. Ảnh hưởng phương thức xử lý chitin từ vỏ tôm mũ ni tới đường khử tạo thành sau 120 h thủy phân
Giải pháp siêu âm gián đoạn 03 lần cho kết quả khả quan nhất, lượng đường khử nhận được đạt (1,274; 1,548 mg/ml so với 1,236; 1,497 mg/ml). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy trong điều kiện sóng siêu âm cường độ cao và thời gian tiếp xúc dài, enzym rất dễ bị mất hoạt lực [33]. Như vậy siêu âm gián đoạn phần nào hạn chế được tác dụng bất lợi của chế độ siêu âm tới hoạt lực enzym.
3.3.2.3. Ảnh hưởng các giải pháp xử lý chitin tới cơ cấu sản phẩm nhận được sau thủy phân
Nguyên liệu chitin tôm mũ ni được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau và tiến hành thủy phân trong 120 h. Định lượng các thành phần (NAG)i (với i = 1-3) trong dịch thủy phân nhận được bằng phương pháp HPLC. Kết quả nhận được thể hiện Hình 3.18, Hình 3.29 A và Bảng 3.7 phù hợp với kết quả nhận được ở các nghiên cứu trên. Cụ thể, kích thước chitin càng nhỏ cho lượng NAG tạo thành càng cao. Phân đoạn MN < 63 μm cho NAG (1,373 mg/ml, tương ứng 36,4% YNAG/ CHITIN); 600 μm < MN < 2 mm cho NAG (0,714 mg/ml, 19,1% YNAG/ CHITIN). Chitin sau nghiền bi có kích thước càng bé thì tác dụng tích cực của các giải pháp siêu âm càng rõ rệt. Tác dụng cải thiện khả năng thủy phân chitin của giải pháp siêu âm lại càng lớn hơn khi siêu âm gián đoạn 03 lần mỗi lần 20 phút. Lượng NAG đạt được cao nhất với phân đoạn bột nghiền kích thước < 63 μm, siêu âm gián đoạn 03 lần mỗi lần 20 phút và bổ sung enzym trước khi siêu âm là 2,303 mg/ml, tương ứng 61,1% YNAG/CHITIN.
Hình 3.18. Sắc ký đồ HPLC của dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau) bởi chế phẩm enzym kỹ thuật trong thời gian 120 h, pic NAG xuất hiện tại thời
gian 13,688 phút .
Bảng 3.7. Hàm lượng (NAG)i (với i từ 1 – 3) trong dịch thủy phân chitin tôm mũ ni (được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau) bởi chế phẩm enzym kỹ thuật trong thời gian 120 h
Kích thước (KT) các phân đoạn
Chitin tôm mũ ni
NAG (mg/ml)
(NAG)2
(mg/ml) 600 μm < KT <2 mm
Không SA 0,567 0,000
SA60' 0,714 0,007
SA60' + E 0,834 0,005
SA20'x3 + E 0,981 0,006
425 μm < KT < 600 μm
Không SA 1,092 0,013
SA60' 1,309 0,012
SA60' + E 1,351 0,009
SA20'x3 + E 1,360 0,000
KT < 63 μm
Không SA 1,373 0,000
SA60' 1,651 0,023
SA60' + E 2,002 0,014
SA20'x3 + E 2,303 0,000
Bảng 3.7 cũng cho thấy dịch đường sau thủy phân chủ yếu là NAG và chứa rất ít đường đôi (NAG)2, chứng tỏ rằng nguyên liệu sau khi xử lý có khả năng thủy phân tốt và triệt để.
Hình 3.19. Ảnh hiển vi điển tử quét của các loại nguyên liệu chứa chitin.A. Chitin tôm mũ ni thô
(MN thô); B. 425 μm < MN < 600 μm; C. MN < 63 μm; D. 425 μm < MN < 600 μm + SA;
E. Chitin mực thô (M thô); K. Chitin tôm sú thô (S thô).
Hình 3.20. Các đường cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) đối với chitin MN ở điều kiện không khí, tốc độ gia nhiệt mẫu 20ºC / phút,
khối lượng mẫu 13,54 mg chitin MN thô (M1_DSC), khối lượng mẫu 9,2 mg chitin MN thô + SA (M2_DSC), khối lượng mẫu 12,10 mg chitin MN < 63 μm (M3_DSC),
khối lượng mẫu 11,11 mg chitin MN < 63 μm +SA (M4_DSC), thời gian SA là 120 h.
Bên cạnh đó, bằng phương pháp phân tích nhiệt vi sai mục 2.2.5, kết quả Hình 3.20 thể hiện: chitin kích thước lớn (dạng chưa qua xử lý nghiền), ta thầy: Mẫu M2_DSC không thay đổi nhiều so với mẫu M1_DSC là do tác động của sóng siêu âm lên chitin không nhiều, chưa đủ mạnh để làm dao động, đứt các liên kết hydro trong vòng cacbon của chitin so với mẫu đối chứng M1_DSC. Cụ thể sự chuyển pha nhiệt độ tại điểm nóng chảy của chitin 323,99oC và 325,20oC lần lượt đối với mẫu M2_DSC và M1_DSC. Trên mẫu chitin kích thước nhỏ (dạng đã qua xử lý nghiền) ta có: Khi so sánh với mẫu đối chứng M1_DSC (MN thô) – mẫu có điểm nóng chảy tại 325,20oC thì sự chuyển pha nhiệt độ gần hơn tại điểm nóng chảy của chitin lần lượt từ 309,92oC, 313,56oC đối với mẫu M4_DSC và M3_DSC là do xử lý nghiền và nghiền kết hợp siêu âm đều làm lỏng bớt các liên kết hydro của các nhóm OH trong vòng cacbon của chitin. Do đó nghiền bi có kích thước càng bé thì giải pháp siêu âm tác động làm lỏng lẻo liên kết của chitin càng mạnh và lúc này khả năng
chịu nhiệt của nó càng giảm. Thể hiện sự chuyển pha nhiệt độ nóng chảy chitin M3_DSC (MN < 63 μm) là 313,56oC, chitin M4_DSC (MN < 63 μm kết hợp siêu âm) là 309,92oC;
trong khi chitin M1_DSC (MN thô) là 325,20oC và chitin M2_DSC (MN thô kết hợp siêu âm là 323,99oC).
3.3.2.4. Ảnh hưởng của tác động nhiệt độ cao và áp suất
Trên cơ sở kết quả nhận được trong những nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn bột chitin tụm mũ ni kớch thước 600 àm < MN < 2 mm làm đối tượng xử lý bổ sung cỏc giải pháp nhiệt độ cao, áp suất và vi sóng để khảo sát ảnh hưởng của chúng tới khả năng thủy phân chitin. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.5.1. Dịch enzym có hoạt độ 0,012 U/ml chitinase và dịch chitin nồng độ 9 mg/ml được sử dụng trong thủy phân với tỷ lệ phối trộn là 1/1 (v/v). Hiệu suất thủy phân chitin trong các mẫu được thể hiện trong Bảng 3.8 và Bảng 3.9.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ, ỏp suất xử lý chitin tụm mũ ni kớch thước 600 àm < MN <
2 mm tới hiệu suất thủy phân (%)
Thời gian thủy phân
(h)
Phương pháp xử lý
Không xử lý
T=100ºC
T = 121ºC, P = 1 atm / 20 phút 20 phút 40 phút
24 8,83 ± 0,87 9,09 ± 0,77 8,79 ± 0,55 8,79 ± 0,74 48 18,17 ± 2,32 17,44 ± 1,61 18,26 ± 2,04 17,36 ± 2,12 72 25,63 ± 2,00 24,86 ± 2,50 25,29 ± 1,91 25,76 ± 1,41 144 48,26 ± 2,43 48,65 ± 2,01 48,18 ± 1,83 47,96 ± 2,12 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi súng xử lý chitin tụm mũ ni kớch thước 600 àm < MN < 2 mm tới
hiệu suất thủy phân (%) Thời
gian (h)
Không xử lý Xử lý vi sóng
60 giây 90 giây 120 giây
120 37,33 ± 1,20 36,63 ± 2,64 37,28 ± 2,09 37,29 ± 2,02 144 48,05 ± 1,47 48,79 ± 1,86 48,42 ± 1,73 48,70 ± 1,72
Kết quả nhận được trong Bảng 3.8 và Bảng 3.9 cho thấy không có sự tác động khả quan nào của tất cả các phương pháp xử lý nhiệt, áp suất và vi sóng đã nghiên cứu. Lượng đường khử nhận được trong quá trình thủy phân ở các mẫu có áp dụng xử lý và không xử lý không có sự khác biệt.
Theo nghiên cứu của Roy và cs (2003), chitin vừa được khuấy từ liên tục, vừa được chiếu xạ vi sóng (tần số 2,5 GHz) ở 57,5ºC trong 38 phút cho hiệu quả cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng chỉ được làm nóng ở nhiệt độ tương ứng và không xử lý vi sóng [120].
Ngoài ra chúng tôi chọn chitin tôm mũ ni kích thước từ 425 μm đến 600 μm làm đối tượng xử lý bằng các giải pháp nhiệt độ 150ºC và áp suất 2 psi trong 20 phút, siêu âm (SA) có mặt enzym gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phút) để khảo sát ảnh hưởng của chúng tới khả năng thủy phân chitin. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.5.1.
Dịch enzym có hoạt độ 0,005 U/ml và dịch cơ chất 5 mg/ml chitin được sử dụng torn thủy phân với tỷ lệ phối trộn là 1/1 (v/v). Hiệu suất thủy phân chitin trong các mẫu được thể hiện Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ 150ºC kết hợp với áp suất 2 psi; SA gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phỳt) cú mặt enzym lờn chitin tụm mũ ni kớch thước 425 àm <MN< 600 àm tới hiệu suất thủy
phân (%)
Thời gian (h)
Phương pháp xử lý
Không xử lý
T = 150ºC, P = 2psi / 20 phút
E+SA 20 phút x 3 lần
72 35,53 ± 1,06 40,16 ± 1,16 43,99 ± 1,30
96 36,86 ± 0,80 46,98 ± 1,25 50,27 ± 1,36
120 38,70 ± 0,98 49,04 ± 1,42 59,19 ± 1,46
Kết quả Bảng 3.10 cho chúng ta thấy xử lý nhiệt độ 150ºC và áp suất 2 psi trong thời gian 20 phỳt lờn bột chitin tụm mũ ni kớch thước 425 àm < MN < 600 àm làm tăng khả năng thủy phân chitin hơn so với không xử lý (cụ thể sau 96 h cũng như 120 h thủy phân, HSTP tăng khoảng 10%). Tuy nhiên có thể thấy tác động kết hợp nhiệt 150ºC với áp suất 2 psi trong thời gian 20 phút vẫn kém hơn tác động siêu âm gián đoạn 3 lần có mặt enzym, mỗi lần 20 phút (sau 120 h thủy phân, HSTP thấp hơn 10%).
Bờn cạnh đú, Guadalupe và cs (2013) khảo sỏt trờn chitin kớch thước 177 àm cho thấy phương pháp nổ hơi có hiệu quả hơn phương pháp siêu âm. Cụ thể, siêu âm trong đệm citrate phosphate (pH 6) sau 20 phút tạo tối đa 0,25 mg/ml NAG nhưng nổ hơi trong 8 phút ở 180ºC và áp suất 1 MPa tạo 0,59 mg/ml NAG, nổ hơi trong 5 phút tạo 0,38 mg/ml NAG [43]. Do đó, phương pháp xử lý nhiệt độ và áp suất có thể giúp tăng hiệu quả thủy phân hơn nữa khi được áp dụng ở điều kiện xử lý cao hơn, hoặc nếu có thể áp dụng phương pháp nổ hơi.
3.3.2.5. Ảnh hưởng của tác động xử lý hóa học và vật lý Nguyên liệu chitin thô và chitin qua nghiền:
Chitin tôm mũ ni thô được lựa chọn làm đối tượng cho các giải pháp xử lý: siêu âm (SA) có mặt enzym gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phút); khuấy nhiệt 100ºC với Triton 2%
trong thời gian 60 phút; khuấy nhiệt 100ºC với Urea 2 M trong thời gian 60 phút; trộn 0,1% H2SO4 ở T = 121ºC, P = 1 atm trong 20 phỳt; nghiền kớch thước từ 425 àm đến 600 μm để khảo sát ảnh hưởng của chúng tới khả năng thủy phân chitin. Dịch enzym có hoạt
độ 0,006 U/ml chitinase và dịch cơ chất 5 mg/ml chitin (đã xử lý trên) phối trộn với tỷ lệ là 1/1 (v/v), ta có kết quả Bảng 3.11 và Bảng 3.12.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý hóa học và vật lý lên chitin tôm mũ ni thô tới hiệu suất thủy phân (%)
Phương pháp xử lý
Thời gian (h)
72 96 120
Không xử lý 14,13 ± 0,77 18,56 ± 1,04 20,26 ± 1,37 E + SA 20 phút x 3 lần 19,71 ± 1,88 24,07 ± 1,73 26,94 ± 1,14 Khuấy nhiệt 100ºC / 60 phút +
Triton 2% 24,79 ± 1,50 29,21 ± 1,32 32,84 ± 1,56 Khuấy nhiệt 100ºC / 60 phút +
Urea 2 M 24,41 ± 1,62 29,58 ± 1,68 32,67 ± 1,82 0,1% H2SO4 + T = 121ºC, P =
1atm/ 20 phút 24,68 ± 1,43 30,00 ± 1,30 32,97 ± 1,25 Nghiền kích thước
425 μm <MN < 600 μm 37,02 ± 1,84 39,18 ± 1,85 41,58 ± 1,04 Kết quả Bảng 3.11 cho thấy xử lý khuấy nhiệt 100ºC với Triton 2% trong thời gian 60 phút; khuấy nhiệt 100ºC với Urea 2 M trong thời gian 60 phút; trộn 0,1% H2SO4 ở T = 121ºC, P = 1atm trong 20 phút đều làm tăng khả năng thủy phân chitin (HSTP tăng lên khoảng 10% – 12%) và cho hiệu quả thủy phân tốt hơn so với xử lý nguyên liệu bằng siêu âm (SA) có mặt enzym gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phút) (HSTP cao hơn 6%). Kết hợp với kết quả Bảng 3.10, ta thấy cả ba phương pháp xử lý này đều cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp xử lý 150ºC, 2 psi. Tuy vậy khả năng thủy phân vẫn thấp hơn so với thủy phõn chitin tụm mũ ni kớch thước 425 - 600 àm (HSTP thấp hơn khoảng 9% - 12%).
Kết quả nghiên cứu này tương tự kết quả đã công bố của một số tác giả, Haynes và cs khảo sỏt chitin kớch thước từ 180 àm đến 250 àm, nguyờn liệu được xử lý nổ hơi với 0,01% H2SO4 cho hiệu quả cao hơn so với nguyên liệu không được xử lý [51].
Triton X – 100 và Urea giúp tác động vào tương tác kỵ nước, làm suy yếu liên kết hydro trong cấu trúc tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động enzym [64], khuấy nhiệt có thể đã giúp tăng độ hoạt động và khuyếch tán của dung môi tới nguyên liệu do đó khả năng thủy phân được cải thiện tốt.
Như vậy xử lý nghiền kớch thước từ 425 - 600 àm cho hiệu quả thủy phõn chitin tụm mũ ni cao hơn hẳn so với các phương pháp xử lý khác trên Bảng 3.11.
Do đú chitin mũ ni kớch thước 425 àm - 600 àm được lựa chọn làm đối tượng xử lý cho các phương pháp: khuấy nhiệt 100ºC với Triton 2% trong thời gian 60 phút; khuấy
nhiệt 100ºC với Urea 2 M trong thời gian 60 phút; siêu âm (SA) có mặt enzym gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phút); SA với Triton 2% trong thời gian 60 phút; SA với Urea 2 M trong thời gian 60 phút, ta có kết quả Bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý hóa học và vật lý lên chitin tôm mũ ni kích thước 425 àm <MN< 600 àm tới hiệu suất thủy phõn (%)
Phương pháp xử lý
Thời gian (h)
72 96 120
Không xử lý
Khuấy nhiệt 100°C/ 60 phút + Triton
2% 45,58 ± 1,61 53,20 ± 1,68 59,56 ± 1,71 Khuấy nhiệt 100°C/ 60 phút + Urea 2
M 45,55 ± 2,09 53,43 ± 2,03 59,88 ±1,50
E+SA 20 phút x 3 lần 46,09 ± 1,92 53,36 ± 1,67 59,94 ± 1,64 Triton 2% + SA 60 phút 45,16 ± 2,52 53,50 ± 1,85 59,48 ± 1,35 Urea 2 M + SA 60 phút 45,22 ± 2,75 53,40 ± 1,81 59,28 ± 1,56 Các kết quả Bảng 3.12 cho thấy các phương pháp xử lý đều làm tăng như nhau về khả năng thủy phân chitin (HSTP tăng lên khoảng 9% - 19% ở các thời điểm thủy phân 72 h đến 120 h).
Như vậy xử lý SA trong 60 phút không cải thiện HSTP đối với chitin tôm mũ ni kích thước 425 - 600 àm đó xử lớ húa chất Triton 2% hay Urea 2 M.
Nguyên liệu gel chitin
Gel chitin hay chitin huyền phù được xử lý hóa học bằng HCl đậm đặc theo phương pháp cải tiến của Roberts và Selitrenniko (Mục 2.3.5.1).
Tương tự như xử lý trên chitin thô và chitin nghiền, chúng tôi tiến hành xử lý gel chitin bằng các phương pháp vật lý khác nhau (Vi sóng 60 giây, siêu âm (SA) có mặt enzym gián đoạn 3 lần (mỗi lần 20 phút), nhiệt độ 100°C trong 20', nhiệt 100°C và P = 1atm trong 20') hoặc bằng các phương pháp hóa học (Urea 0,2 M; Urea 0,1 M; Urea 0,05 M). Sau đó phối trộn dịch enzym (hoạt độ 0,01 U/ml chitinase và dịch gel chitin đã xử lý trên (416 mg/ml, tương đương khoảng 21,9 mg/ml chitin thô) với tỷ lệ 1/1 (v/v) ta có HSTP tương đối trên Bảng 3.13 và Bảng 3.14.
Gel chitin chứa Urea ở các nồng độ thấp 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M và được tiến hành thủy phân bằng enzym để đánh giá xem sự có mặt của Urea trong phản ứng thủy phân có giúp cải thiện khả năng thủy phân hay không (Bảng 3.14).
Kết quả cho thấy gel chitin chứa nồng độ Urea dù rất thấp nhưng vẫn làm giảm HSTP xuống so với gel không chứa hóa chất.