3.3. ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT THỦY PHÂN CHITIN
3.3.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân chitin
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mục 2.3.5.2. Xác định hoạt độ chitinase như công thức (2.3) ở mục 2.2.3. Quá trình thủy phân thực hiện ở các nhiệt độ trong khoảng 30 - 45oC, pH 5. Trong thời gian thủy phân tính hiệu suất thủy phân (HSTP) tương đối theo công thức (2.9) ở mục 2.3.5.1.
Hình 3.22. (A) Ảnh hưởng nhiệt độ lên NAG tạo thành khi pH 5. Quá trình thủy phân được thực hiện ở 45ºC (), 30ºC (), 35ºC (), 40ºC (). (B). Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin bởi chế phẩm chitinase kỹ thuật sau 36 h thủy phân. (1) Chất NAG chuẩn; (2) ở
45ºC; (3) ở 40ºC; (4) ở 35ºC; (5) Kiểm chứng - enzym; (6) Kiểm chứng - gel chitin.
Kết quả Hình 3.22 A thể hiện HSTP tương đối chitin ra NAG tăng mạnh gần 36 h thủy phân, sau đó hầu như không tăng nữa ở các nhiệt độ 35oC và 40oC và đạt giá trị lớn nhất 83% và 88%. Ở nhiệt độ thấp hơn 30oC, tốc độ thủy phân chậm hơn và đạt giá trị cao
nhất sau 36 h là 73%. Tuy nhiên, sự thủy phân chitin ở 45ºC dừng rất sớm (chỉ sau 24 h) và HSTP tương đối nhận được rất thấp 63%. Do vậy, nhiệt độ tối ưu cho thủy phân chitin được xem là 40ºC.
Phân tích sắc ký bản mỏng Hình 3.22 B cho thấy: sản phẩm phân giải chính là NAG ở 35ºC, 40ºC hoặc 45ºC, điều này chứng tỏ nhiệt độ không làm thay đổi thành phần trong sản phẩm thủy phân.
Kết quả của chúng tôi là phù hợp với nghiên cứu đã công bố rằng nhiệt độ tối ưu 35ºC và 40ºC đã được khảo sát đối với chitinase tinh sạch và NAHase từ P. oxalicum [116, 118].
3.3.3.2. Ảnh hưởng pH
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mục 2.3.5.2. Xác định hoạt độ chitinase như công thức (2.3) ở mục 2.2.3. Quá trình thủy phân thực hiện ở các giá trị pH trong khoảng pH 3 - pH 8. Trong thời gian thủy phân xác định hiệu suất thủy phân tương đối như công thức (2.9) ở mục 2.3.5.1.
Trong dãy pH nghiên cứu, HSTP tương đối gần như nhau tại pH 4 - 6, và đạt lớn nhất 88% ở pH 5. Thủy phân chitin bởi chitinase ở pH axit tốt hơn ở pH kiềm. HSTP tương đối ở pH 7 và pH 8 giảm 1,7 lần so với ở pH 5. Mặc dù có sự thay đổi HSTP tương đối trong dãy pH 3 - 7 kiểm tra, nhưng thành phần của sản phẩm thủy phân là như nhau (Hình 3.23 A). NAG là sản phẩm chính trên sắc ký bản mỏng Hình 3.23 B.
Hình 3.23. (A) Ảnh hưởng pH lên NAG tạo thành. Quá trình thủy phân được thực hiện ở 40ºC. (B) Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân từ gel chitin bởi chế phẩm chitinase kỹ thuật sau 24 h thủy phân. (1) Chất chuẩn NAG; (2) pH 3; (3) pH 4; (4) pH 5; (5) pH 6; (6) pH 7;
(7) Kiểm chứng – enzym; (8) Kiểm chứng – gel chitin.
Do vậy điều kiện tối ưu 40oC, pH 5 được chọn để thủy phân chitin bởi chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P. oxalicum 20B. Bên cạnh đó, nhiệt độ 45oC và pH 5 là điều kiện tối ưu cho chitinase thô từ Aeromonas sp. GJ-18 cho thủy phân chitin [74].
3.3.3.3. Ảnh hưởng nồng độ gel chitin
Cơ chất nồng độ từ 20% tới 40% gel chitin (v/v) tương ứng 200 mg/ml tới 416 mg/ml gel chitin như trong mục 2.3.5.2 được thủy phân bởi chế phẩm enzym kỹ thuật có hoạt độ 3,867 mU/ml chitinase với tỷ lệ enzym và cơ chất là 1/1 (v/v). Các kết quả được chỉ ra trên Hình 3.24.
Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ gel chitin lên thủy phân gel chitin. (A) nồng độ NAG (mg/ml), (B) Hiệu suất thủy phân tương đối (%).Quá trình thủy phân được thực hiện khi phối trộn dịch
enzym kỹ thuật 3,867 mU/ml chitinase và gel chitin với tỷ lệ 1/1 (v/v) ở pH 5, 40ºC.
Kết quả nhận được cho thấy khi tăng nồng độ chitin thì NAG tạo thành tăng. Giữ nồng độ chitinase không đổi 3,867 mU/ml, khi tăng nồng độ chitin thì lượng đường khử tạo thành tăng (Hình 3.24 A). Tuy nhiên hiện tượng đình trệ thủy phân chitin nồng độ cao đã được nhận thấy (Hình 3.24 B). Cụ thể, HSTP ra đường khử sau thời gian thủy phân 12 h và 24 h là giảm đỏng kể (gần ẵ) lần lượt từ 41% xuống 20% và từ 63% xuống 34%. Quỏ trình thủy phân gần như đã kết thúc ở nồng độ chitin 200 mg/ml sau thời gian ủ 36 h.
Trong khi đó, ở nồng độ chitin 416 mg/ml, sự thủy phân dường như vẫn tiến chuyển khi lượng đường khử tăng dần trong thời gian 144 h ủ. Do đó HSTP đường khử bị giảm nhẹ khi nồng độ chitin 416 mg/ml ở 144 h thủy phân so với khi nồng độ chitin 200 mg/ml (86% đến 82%). Sự đình trệ thủy phân có thể do sự khuếch tán kém vì nồng độ chitin cao đã gây rất nhớt [57]. Nên nồng độ cơ chất càng cao thì nồng độ đường khử tạo thành càng lớn, tuy nhiên có giới hạn. Do đó 416 mg/ml là nồng độ gel chitin cao nhất có thể đạt được
lựa chọn. Bên cạnh đó, nồng độ chitin cao cần kéo dài thêm thời gian ủ thì mới thủy phân hết chitin, nhưng thời gian ủ kéo dài đã gây bất lợi do dịch thủy phân chứa NAG dễ nhiễm tạp.
3.3.3.4. Ảnh hưởng nồng độ enzym
Ảnh hưởng nồng độ enzym tới thủy phân gel chitin được khảo sát theo phương pháp mục 2.3.5.2, HSTP tương đối ra NAG mục 2.3.5.1 cho kết quả Hình 3.25.
Hình 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ enzym lên thủy phân gel chitin. Quá trình thủy phân thực hiện khi phối trộn dịch enzym kỹ thuật có hoạt độ chitinase khác nhau và cơ chất 40% gel chitin với tỷ
lệ 1/1 (v/v) ở pH 5, 40ºC
Nồng độ enzym tăng làm tăng tốc độ thủy phân trong 48 h đầu (độ dốc đường cong tăng. Với nồng độ enzym thấp 1,385 mU/ml, quá trình thủy phân diễn ra chậm trong suốt thời gian ủ, đạt 62,3% tại 144 h. Hiệu suất thủy phân nhận được tăng khi tăng nồng độ enzym trong phản ứng. Tuy nhiên, trong cùng thời điểm ủ 96 h, nồng độ enzym lần lượt 11,600 mU và 22,405 mU cho HSTP đạt cao nhất và không khác nhau nhiều lần lượt 84,3% và 88,5%. Do đó nồng độ enzym 11,600 mU là đủ để thủy phân 416 mg gel chitin không làm giảm tới HSTP tương đối cực đại tại thời điểm thủy phân từ 96 h đến 144 h.
HSTP tương đối ra NAG đạt 79% sau 24 h thủy phân gel chitin bởi chitinase thô từ Aeromonas sp. PTCC1691 ở nồng độ enzym so với cơ chất là 2 U mg-1 [57]. Công bố enzym thô từ Aeromonas sp. GJ-18 thủy phân gel chitin khi nồng độ enzym so với nồng độ chitin là 0,1 U mg-1 ở 40ºC, pH 5 sau thời gian lần lượt 120 h và 216 h cho HSTP ra NAG tương ứng 83,0% và 94,9% [74].
Trong ngiên cứu của chúng tôi HSTP ra NAG 88,5% và 89,7% đã đạt được lần lượt trong 96 h và 144 h thủy phân khi tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ chitin là 0,054 mU mg-1. Tuy nhiên hàm lượng nước của gel chitin trong các nghiên cứu trên có thể là khác với hàm lượng nước trong gel chitin của chúng tôi. Từ nghiên cứu trên, giữa nồng độ enzym so với nồng độ cơ chất được tính toán để đưa ra ảnh hưởng của nồng độ chitin và tỷ lệ giữa nồng độ enzym với nồng độ chitin lên hiệu suất tạo thành NAG sau 48 h thủy
phân (Bảng 3.17).
Kết quả Bảng 3.17 phù hợp với lý thuyết là thủy phân cùng chung một nồng độ chitin (các mẫu 1, 2, 3, 4 hay 5, 6, 7), tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ cơ chất càng cao thì HSTP tương đối ra NAG càng lớn. Hơn nữa khi cùng chung tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ cơ chất thì HSTP ra NAG đạt cao hơn ở nồng độ chitin thấp (Mẫu 3, 6 hay 4, 7).
Bảng 3.17. Ảnh hưởng tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ chitin lên hiệu suất thủy phân ra NAG sau 48 h thủy phân (khi dịch enzym/ dịch chitin là 1/1 (v/v))
Mẫu
Hoạt độ enzym (mU/ml)
Tỷ lệ giữa nồng độ enzym so với nồng độ cơ chất
(mU/mg)
Nồng độ chitin (mg/ml)
HSTP NAG
(%)
1 1,365 0,003 416 29,4
2 3,867 0,009 416 57,6
3 11,6 0,028 416 69,2
4 22,405 0,054 416 75,5
5 3,867 0,015 253 75,4
6 7,051 0,028 253 86,4
7 13,64 0,054 253 87,9
Kết quả Hình 3.25 cho thấy thủy phân dịch 40% gel chitin bởi chế phẩm kỹ thuật chitinase 22,405 mU/ml (tỷ lệ dịch enzym với dịch gel chitin là 1/1 (v/v)) thành dịch NAG với HSTP tương đối 89,7% phải mất khoảng thời gian 144 h. Do vậy để rút ngắn thời gian thủy phân trong 24 h, tăng nồng độ chế phẩm enzym cần được nghiên cứu. Khi tăng nồng độ chế phẩm enzym từ 1,367 mU/ml đến 239,103 mU/ml chitinase thì lượng NAG thu được theo phương pháp HPLC thể hiện trên Hình 3.26.
Hình 3.26. Ảnh hưởng nồng đột enzym tới khả năng thủy phân cơ chất 40% gel chitin lên NAG tạo thành trong 24 h ở pH 5, 40ºC, tỷ lệ dịch enzym/dich gel chitin là 1/1 (v/v)
Với thời gian 24 h, cơ chất 40% gel chitin được thủy phân bởi các chế phẩm chitinase có hoạt độ chitinase khác nhau (Tỷ lệ enzym/cơ chất là 1/1 (v/v)) như Hình 3.26, chúng tôi thấy hoạt độ chitinase tăng từ 1,365 mU/ml đến 105,783 mU/ml làm HSTP ra NAG tăng mạnh. Sự tăng HSTP ra NAG chậm dần khi hoạt độ chitinase từ 105,783 mU/ml đến 239,103 mU/ml. Do đó khi tăng hoạt độ chitinase hơn 105,783 mU/ml thì tiết kiệm được thời gian thủy phân, nhưng hiệu quả kinh tế giảm. Tuy nhiên với mục đích rút ngắn thời gian trong nghiên cứu thu dịch thủy phân chứa NAG, chúng tôi chọn chế phẩm enzym kỹ thuật 239,103 mU/ml chitinase thủy phân cơ chất 40% gel chitin ra NAG với HSTP cao nhất đạt 89,43% (nồng độ chất khô hòa tan Bx = 2,2% (ở phụ lục 8)).