3.4. NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM NAG
3.4.4. Đề xuất và ứng dụng qui trình thu nhận NAG
Từ nghiên cứu trên, tác giả đề xuất qui trình thu nhận NAG từ chitin tôm mũ ni như sau:
Chuẩn bị gel chitin từ chitin tôm mũ ni như phương pháp mục 2.3.5.1. Sử dụng chế phẩm enzym kỹ thuật hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, tỷ lệ H/E là 0,170 (với NAHase 2,152 U/ml và endochitinase 12,695 U/ml) thủy phân cơ chât 40% gel chitin (tỷ lệ giữa dịch chế phẩm chitinase kỹ thuật và dịch gel chitin là 1/ 1 (v/v), ở điều kiện pH 5, 40oC, trong thời gian 24 h) như qui trình Hình 3.31 ở trang sau.
3.4.4.2. Ứng dụng qui trình thu nhận NAG với qui mô 5 lit dịch thủy phân
5 lit dịch thủy phân ban đầu (nồng độ chất khô hòa tan Bx = 2,2%) được loại cặn nhờ ly tâm 6000 v/p trong 10 phút. Sau đó đi qua hệ thống lọc dòng ngang chỉ thu 4,750 lít dịch qua màng (theo nghiên cứu trên Bảng 3.18). Dịch lọc qua màng được tiến hành cô đặc bởi hệ thống cô quay chân không ở nhiệt độ 60oC, vận tốc quay 30 v/p, áp suất 68 - 72 mbar cho tới khi mức độ cô đặc đạt 15,71 lần (nồng độ chất khô hòa tan 29,3%). Dịch thủy phân cô đặc được kết tinh lần 1 ở 4oC trong 24 h, loại tạp chất kết tinh lần 1 và thu dịch nổi.
Tiếp theo bổ sung EtOH 99o vào dung dịch nổi với tỷ lệ EtOH/dịch nổi là 9/1 ở 4oC trong 24 h để loại cặn kết tủa, thu dung dịch trong. Sau đó dung dịch trong này được loại EtOH bởi hệ thống cô quay chân không ở nhiệt độ 55oC, vận tốc quay 30 v/p, áp suất 75 - 80 mbar, rồi thực hiện kết tinh lần 2 thu tinh thể NAG ở 4oC trong 24 h và phần dịch không kết tinh được. Các tinh thể NAG (kết tinh lần 2) được rửa bằng 50 ml EtOH 99° và sấy 60oC thu nhận sản phẩm NAG.
NAG trong dịch không kết tinh, NAG trong cặn kết tủa bởi EtOH và NAG trong sản phẩm tinh sạch được xác định theo phương pháp HPLC ta có kết quả Hình 3.32. Từ kết quả Hinh 3.32 có thể thấy lượng tạp chất đã được loại bỏ trong cặn kết tủa bởi EtOH (Hình 3.32 C) và dịch không kết tinh (Hình 3.32 D). Sản phẩm NAG tinh sạch chỉ chứa 1 pic duy nhất tương ứng với NAG. Độ tinh sạch NAG và HSTH NAG được xác định bởi công thức.
Độ tinh sạch NAG và HSTH NAG được xác định bởi công thức (2.12), (2.13) mục 2.3.6 cho kết quả Bảng 3.21.
Hình 3.31. Sơ đồ quy trình thu nhận sản phẩm NAG
Hình 3.32. Kết quả phân tích HPLC trong mẫu chứa NAG
A. Mẫu hỗn hợp chất chuẩn 1NAG, 2NAG, 3NAG; B. Mẫu sản phẩm sau tinh sạch;
C. Mẫu kết tủa EtOH; D. Mẫu dịch không kết tinh.
Bảng 3.21. Kết quả tinh sạch chế phẩm NAG
Bước
Thể tích (ml)
Bx (%)
Khối lƣợng
(mg)
NAG (mg/ml)
NAG (mg)
HSTH NAG
(%)
Độ tinh sạch NAG
(%) Dịch thủy
phân sau lọc
dòng ngang 4750 2,2 9,756 46341,00 100,00 Dịch sau cô
đặc 302,4 29,3 145,757 44070,39 95,10
Hạt kết tinh dịch sau
cô đặc 44350 501,00 1,08
Cặn sau kết tủa
bởi EtOH 28787 431,19 0,93
Kết tinh chế
phẩm NAG 37102 34609,20 74,68 93,28
Dịch không
kết tinh 82 90,060 7384,92 15,94
Từ kết quả Bảng 3.20 và Bảng 3.21 cho thấy cùng chung dịch thủy phân sau cô đặc 15,71 lần, thực hiện tinh sạch và thu nhận chế phẩm NAG với qui mô lớn cho HSTH và độ tinh sạch chế phẩm NAG cao hơn chút ít thể hiện Bảng 3.22.
Như vậy, sản phẩm NAG được chúng tôi thu nhận theo qui trình Hình 3.31 với hiệu suất thu hồi đạt 63,78% là cao hơn so với nghiên cứu của Aiba [7] (đạt hiệu suất thu hồi 43%), nhưng lại thấp hơn so với công bố của Setthakaset và cs [132] cũng như Ajavakom và cs [10] (đều đạt hiệu suất thu hồi 65%); và độ tinh sạch sản phẩm NAG đạt 93,28% lại thấp hơn so với nghiên cứu của Aiba [7] cũng như Ajavakom và cs [10] (đều cho độ tinh sạch trên 95%) nhưng lại cao hơn công bố của Setthakaset và cs [132] (độ tinh sạch đạt 70%).
Bảng 3.22. Qui mô thí nghiệm ảnh hưởng tới HSTH và độ tinh sach chế phẩm NAG Qui mô
dịch sau thủy phân
(ml)
Tỷ lệ cô đặc (lần)
HSTP (%)
HSTH NAG sau lọc dòng
ngang (%)
HSTH NAG từ dịch thủy phân sau lọc dòng
ngang (%)
HSTH từ chitin
ra NAG (%)
Độ tinh sạch chế phẩm NAG
(%)
75,5 15,71 89,43 95,5 74,47 63,60 93,25
5000 15,71 89,43 95,5 74,68 63,78 93,28
Ngoài ra, kết quả phân tích nhiệt vi sai Hình 3.33 A cho thấy sự chuyển khối lượng diễn ra đối với sản phẩm NAG sau tinh sạch tại nhiệt độ 200,61ºC, đối với NAG của hãng Sigma diễn ra ở nhiệt độ 209,05oC. Sản phẩm NAG sau tinh sạch có điểm nóng chảy bắt đầu diễn ra ở nhiệt độ 546,83ºC nhưng điểm nóng chảy của NAG Sigma diễn ra ở nhiệt độ 526,35ºC. Do vậy, sản phẩm NAG sau tinh sạch bền nhiệt hơn so với NAG hãng Sigma.
A
B
Hình 3.33. A. Các đường cong phân tích nhiệt vi sai (DSC) ở điều kiện không khí, tốc độ gia nhiệt mẫu 20ºC / phút, khối lượng mẫu 9,0 mg sản phẩm NAG sau tinh sạch (M6_DSC), khối lượng mẫu
11,21 mg NAG của hãng Sigma (M7_DSC). B. Phổ FTIR của sản phẩm NAG sau tinh sạch (M6_FTIR) và NAG hãng Sigma (M7_FTIR)
Hình 3.33 B biểu thị phổ FTIR của sản phẩm NAG sau tinh sạch (M6_FTIR) và NAG hãng Sigma (M7_FTIR). Hình dạng đỉnh (peak) trong khoảng 4000 - 700 cm-1 của
phổ M6_FTIR và phổ M7_FTIR gần như giống nhau nên cấu trúc của chúng được coi như tương đương. Thêm nữa, theo Focher và cs (1990) [37], cũng như Wu và cs (2005) [168]
thì mức độ tinh thể được ước đoán thông qua tỷ lệ A1379,88/ A2932,69 cm-1 (trên M6_FTIR), A1380,33/ A2932,78 cm-1 (trên M7_FTIR) lần lượt là 0,9676 và 0,9664. Do vậy mức độ tinh thể của sản phẩm NAG chế biến được và NAG hãng Sigma dường như giống nhau. Kết quả phân tích này góp phần minh chứng với độ tinh sạch sản phẩm NAG sau tinh sạch 93,28%
là gần với độ tinh sạch 100% của sản phẩm NAG Sigma.