3.1. NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P. OXALICUM 20B
3.1.1. Ảnh hưởng của môi trường lên men
3.1.1.1. Ảnh hưởng của dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase
Ảnh hưởng của dạng chitin thô, chitin nghiền, gel chitin cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp chitinase được mô tả trong mục 2.3.1. Theo thời gian, hoạt tính chitinase trong dịch lên men được xác định và kết quả thể hiện trên Hình 3.1.
0.009
0.062 0.065 0.063
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080
Không có chitin Chitin thô Chitin nghiền (600μm - 2mm)
Chitin dạng gel
Hoạt độ chitinase (U/ml)
72 h 96 h 120 h 144 h
Hình 3.1. Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men
Kết quả Hình 3.1 cho thấy dạng chitin ảnh hưởng không nhiều đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của P. oxalicum 20B. Hoạt tính chitinase nhận được tương đương nhau dao động trong khoảng 0,062 U/ml đến 0,065 U/ml trong quá trình lên men và đạt cao nhất ở thời điểm 120 h. Trái với nghiên cứu của chúng tôi, Saima và cs (2013) đã công bố trong số các dạng chitin như chitin dạng thô, dạng bột và dạng gel, chitin dạng gel là chất cảm ứng tốt nhất cho sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas hydrophila HS4 cũng như từ A.
punctata HS6 [124]. Kim và cs (1998) công bố gel chitin và chitin dạng bột (kích thước nhỏ hơn 250 àm) cho hoạt tớnh chitinase cao nhất trong 7 ngày lờn men từ Serratia marcescens QM B1466 [67]. Chen và cs (2014) nghiên cứu sinh tổng hợp chitinnase từ chủng Aeromonas schubertii cho thấy kớch thước bột chitin trong khoảng 30 - 35 àm cho hoạt tớnh chitinase tương tự nhau, nhưng kớch thước nhỏ 12 àm thỡ hoạt tớnh chitinase nhận
được lại giảm nhiều [28].
Trên cơ sở kết quả này chúng tôi lựa chọn chitin dạng thô làm chất cảm ứng nhằm giảm công sức, hóa chất và năng lượng.
3.1.1.2. Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase
Trong thí nghiệm tiếp theo nồng độ chitin dạng thô thay đổi dao động trong khoảng 0 g/l tới 6 g/l. Cách tiến hành thí nghiệm được trình bày trong mục 2.3.1 và kết quả xác định hoạt tính chitinase trong quá trình lên men được thể hiện trên Hình 3.2.
0.009
0.043
0.053
0.064
0.050
0 0.02 0.04 0.06 0.08
0 1 2 4 6
Hoạtđộchitinase(U/ml)
Nồng độ chitin thô (g/l) 72 h 96 h 120 h 144 h
Hình 3.2. Ảnh hưởng nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men.
Hình 3.2 cho thấy thiếu chất cảm ứng chitin, hoạt độ chitin thu được gần như bằng không chứng tỏ vai trò quan trọng của chitin trong sinh tổng hợp chitinase từ P. oxalicum 20B. Khi tăng nồng độ chitin dạng thô từ 0 g/l đến 4 g/l, khả năng sinh tổng hợp chitinase tăng và đạt cực đại 0,064 U/ml ở nồng độ 4 g/l chitin thô, nhưng tiếp tục tăng tới 6 g/l làm hoạt tính chitinase giảm xuống còn 0,050 U/ml. Thiếu chất chitin, hoạt độ chitinase thu được gần như bằng không chứng tỏ vai trò quan trọng của chitin như chất cảm ứng. Singh (2010) cũng nhận thấy hiện tượng này trong nghiên cứu tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ Paenibacillus sp. D1 [138].
Rodri’guez và cs (1993) sử dụng lượng chitin cho chủng P. oxalicum sinh tổng hợp chitinase là 2 g/l [117]. Khi lên men bán rắn chủng P. citrinum, Hà (2013) nhận được hoạt tính chitinase cao với nồng độ chitin 5 g/l đến 10 g/l [4]. Saima và cs (2013) đã khảo sát ảnh hưởng chitin dạng gel trong khoảng nồng độ 1 g/l đến 12 g/l tới khả năng sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas hydrophila HS4, cũng như từ A. punctata HS6 và khẳng định nồng độ gel chitin 3 g/l là tối ưu cho sinh tổng hợp chitinase [124].
Do đó nồng độ chitin dạng thô 4 g/l là tối ưu để P. oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase.
3.1.1.3. Ảnh hường của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase
Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp chitinase được thực hiện trên 05 nguồn khác nhau với cùng lượng 10 g/l. Lên men thu nhận chitinase trong điều kiện mô tả ở mục 2.3.1. Định kỳ thu dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase, ta có kết quả được trình bày trên Hình 3.3.
0.066
0.021
0.051
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080
0 có nitơ NaNO3 Urea CNM CNM + Urea
CNM + NaNO3
Hoạt độ chitinase (U/ml)
Nguồn nitơ
72 h 96 h 120 h 144 h
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase tại các thời điểm lên men Kết quả nhận được cho thấy nguồn nitơ là cần thiết cho P. oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase, hoạt tính chitinase gần như bằng không khi thiếu nguồn nitơ. Ngoài ra kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy cao nấm men (CNM) là nguồn nitơ thích hợp nhất. Với CNM hoạt độ chitinase đạt cao nhất (0,066 U/ml), cao gấp 3 lần so với các nguồn nitơ vô cơ NaNO3 và urea. Khi kết hợp CNM với nguồn nitơ vô cơ thì hoạt tính chitinase nhận được thấp hơn so với trường hợp chỉ sử dụng CNM làm nguồn nitơ. Tương tự với kết quả của chúng tôi, Suresh và Chandrasekaran (1999) dùng CNM làm nguồn nitơ trong môi trường bán rắn cho Trichoderma asperellum UTP-16 sinh tổng hợp chitinase tốt nhất [146]. Saima và cs (2013) cũng nhận được CNM là nguồn nitơ thích hợp nhất cho A. punctata HS6 sinh tổng hợp chitinase. Khi kết hợp NaNO3 với CNM, hoạt độ chitinase thấp hơn một chút (hoạt độ chitinase tương đối gần 80%) [124]. Binod và cs (2006) cho thấy bổ sung nguồn nitơ vô cơ là NaNO3 hay urea sinh tổng hợp chitinase từ P. aculeatum trong điều kiện lên men rắn với hoạt độ chitinase tương đối nhận được thấp (khoảng 30%) [19].
Một số tác giả nghiên cứu chủng P. aculeatum trong điều kiện lên men rắn nhận được hoạt tính chitinase cao, hoạt tính endochitinase tăng gấp đôi khi bổ sung NaNO3 [19].
Tác giả Nawani và Kapadnis (2005) đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men bằng phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên toán thống kê cho thấy Streptomyces sp. K 1057 được cung cấp nguồn nitơ từ cả hai nguồn CNM và (NH4)2SO4 thì sản lượng chitinase tăng từ 4 - 10% so với dùng riêng lẻ các nguồn này [102].
Với kết quả nghiên cứu nhận được, chúng tôi chọn CNM làm nguồn nitơ bổ sung vào lên men sinh tổng hợp chitinase để nghiên cứu tiếp.
3.1.1.4. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase
Nghiên cứu lựa chọn nồng độ CNM thích hợp được tiến hành như mục 2.3.1. Hoạt tính chitinase của dịch lên men tại các thời điểm sinh tổng hợp chitinase được trình bày Hình 3.4.
Sau khi lựa chọn CNM làm nguồn nitơ bổ sung, khi tăng nồng độ CNM từ 5 g/l đến 10 g/l, hoạt tính chitinase nhận được tăng đáng kể và đạt cao nhất với nồng độ 10 g/l là 0,065 U/ml, tăng xấp xỉ gấp 2 lần so với ở hàm lượng CNM 5 g/l (0,038 U/ml). Nếu tiếp tục tăng lên 15 g/l thì hoạt độ chitinase giảm hẳn (giảm 3 lần so với 10 g/l). Do vậy chọn hàm lượng CNM là 10 g/l cho những nghiên cứu tiếp theo về sinh tổng hợp chitinase từ P.
oxalicum 20B.
0.038
0.065
0.025
0 0.02 0.04 0.06 0.08
5 10 15
Hoạt độ chitinase (U/ml)
Nồng độ cao nấm men (g/l)
72 h 96 h 120 h 144 h