2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Các đối tƣợng nghiên cứu của luận án là hai loài Artemisia (lá cây), là cây Ngải rừng (Artemisia roxburghiana Bess.) và cây Thanh cao Bắc Bộ (Artemisia dubia Wall. ex Bess. var. longeracemosa Pamp. forma tonkinensis Pamp.), và loài Nghệ Quảng Tây (Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang) (thân rễ). Các mẫu thực vật đã đƣợc TS. Nguyễn Quốc Bình, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thu thập và giám định vào tháng 8 năm 2008 tại Đak Glei, Kontum (cây Thanh cao Bắc Bộ và cây Nghệ Quảng Tây), và tháng 11 năm 2008 tại Quản Bạ, Hà Giang (cây Ngải rừng).
2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, PHÂN TÁCH CÁC HỖN HỢP VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
Để phân tích, phân tách các phần chiết và phân lập các hợp chất đã sử dụng các phương pháp ngâm chiết và chiết phân bố trong các dung môi chọn lọc, các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), sắc ký cột loại trừ theo kích thước (SEC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký cột tinh chế (Mini-C), chiết pha rắn trên pha đảo (RP-SPE), sắc ký cột pha đảo (RP-18), và phương pháp kết tinh chọn lọc.
2.2.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng
Phương pháp này dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ). Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước. Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ nhƣ pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỉ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ,…
2.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức), với lớp silica gel dày 0,2 mm trên nền nhôm.
Phát hiện vệt chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại ở λ = 254 nm và các thuốc thử hiện màu: FeCl3/EtOH 5%, vanilin/H2SO4 đặc 1%.
2.2.3 Sắc ký cột
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi. Cột sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lƣợng mẫu cần phân tách. Chất hấp phụ dùng cho CC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với cỡ hạt là 63-200 àm.
Sắc ký cột nhanh (FC) được thực hiện dưới áp suất nén. Chất hấp phụ cho FC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 63-200, 63-100, và 40-63 àm.
Sắc ký cột tinh chế (Mini-C) đƣợc sử dụng để tinh chế các hợp chất hữu cơ.
Cột sắc ký (0,7-1 cm, i.d.) đƣợc nhồi chất hấp phụ silica gel Merck (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với cỏc cỡ hạt 40-63 và 15-40 àm đến chiều cao 10 cm.
Kỹ thuật nhồi cột ƣớt và đƣa mẫu tẩm trên silica gel lên cột hoặc đƣa mẫu trực tiếp trong dung môi hữu cơ đã được sử dụng cho các phương pháp sắc ký cột CC, FC, và Mini-C.
Dung môi hữu cơ dùng trong sắc ký cột là các dung môi sắc ký n-hexan, CH2Cl2, axeton, EtOAc, và MeOH đƣợc làm khan, chƣng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng.
2.2.4 Sắc ký rây phân tử
Sắc ký rây phân tử được thực hiện theo chế độ CC dưới trọng lực của dung mụi. Chất hấp phụ cho sắc ký là Sephadex LH-20 (cỡ hạt 25-100 àm) (Pharmacia Fine Chemicals, Thụy Điển).
2.2.5 Chiết pha rắn trên pha đảo
Chiết pha rắn trên pha đảo (SPE) là quá trình chuyển chất tan (chất cần phân tích) từ pha lỏng sang pha rắn. Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu, làm giàu, và làm sạch mẫu phân tích. Các cột RP-SPE đƣợc sử dụng là C18 Sep-Pak Vac cartridge (Waters, Hoa Kỳ) và Lichrolut RP-18 (Merck, CHLB Đức).
2.2.6 Phương pháp kết tinh lại
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để phân lập và tinh chế chất rắn.
Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của chất
và tạp chất trong dung môi hoặc hệ dung môi đã chọn và độ tan của chất ở các nhiệt độ khác nhau.
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT
Đã sử dụng kết hợp các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất: bao gồm phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng ion hóa phun bụi điện tử (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao ion hóa phun bụi điện tử (HR-ESI-MS) và ion hóa áp suất khí quyển (HR-APCI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR), và phổ nhị sắc tròn (CD).
2.3.1 Điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên thiết bị Boetius (Đức).
2.3.2 Độ quay cực
Độ quay cực đƣợc đo trên thiết bị Jasco P-1030 digital polarimeter.
2.3.3 Các phương pháp phổ
- Phổ tử ngoại (UV) đƣợc ghi trên thiết bị Jasco V-520 spectrophotometer.
- Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy Impact 410-Nicolet FT-IR (spectrophotometer) hoặc trên máy Horiba FT-710 spectrophotometer.
- Phổ khối lƣợng ESI-MS đƣợc ghi trên thiết bị LC/MSD Trap Agilent Series 1100 với cột Zobax SB C18, dùng 15% MeOH trong (H2O + axit fomic) trong 35 phút, tốc độ dòng là 0,4 ml/phút, Thermo Fischer Scientific LT &
Orbitrap XL Mass Spectrometer.
- Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS và HR-APCI-MS đƣợc ghi trên máy Applied Biosystems QSTAR XL Mass Spectrometer.
- Các phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR/DEPT (125 MHz), HSQC, HMBC, COSY, NOESY đƣợc ghi trên thiết bị Bruker Avance 500 với TMS (tetrametylsilan) là chất chuẩn nội.
- Phổ nhị sắc tròn (CD) đƣợc ghi trên thiết bị Jasco J-720 spectropolarimeter.
2.4 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Một số hợp chất phân lập đƣợc từ các loài cây đƣợc nghiên cứu trong luận án đã được khảo sát in vitro về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định theo phương pháp của Vanden Berghe và Vlietinck [105, 107].
Chương 3