4.2 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY THANH CAO BẮC BỘ (ARTEMISIA
4.3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ cây Nghệ Quảng Tây
Chất CK1 (β-Sitosterol)
Hợp chất CK1 đã đƣợc phân lập từ các phần chiết điclometan (CKD) và etyl axetat (CKE) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 135-136 oC, Rf = 0,67 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 6:1, v:v).
HO
CH(CH3)2 CH2CH3
H
CK1 H
Hợp chất CK1 đã đƣợc nhận dạng là β-sitosterol, một hợp chất phytosterol, trên cơ sở so sánh TLC, co-TLC, và phổ IR với chất chuẩn β-sitosterol.
Chất CK2 (Axit tricosanoic)
Hợp chất CK2 đã được phân lập từ phần chiết điclometan (CKD) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,33 (TLC, silica gel, hệ dung môi n- hexan-axeton 9:1, v:v).
4 2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
OH O
23 3
1
CK2
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất CK2 xác định sự có mặt của một nhóm ankyl mạch dài qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một nhóm metyl cuối mạch ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 23-CH3) và các nhóm metylen dưới dạng một tín hiệu singlet dải rộng ở δH 1,26 (38H, s br) và 1,63 (2H, quintet, J = 7,5 Hz). Sự có mặt một tín hiệu nhóm metylen ở δH 2,35 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2-CH2) cho thấy nhóm này phải liên kết với một nhóm axit cacboxylic. Các dữ kiện phổ 1H-NMR đã xác định cấu trúc axit béo của CK2. Mạch ankyl đã đƣợc xác định dựa trên phổ 1H-NMR là chứa 21 nhóm CH2, do đó, CK2 đã đƣợc xác định là axit tricosanoic.
Chất CK3 (Gweicurculacton)
Hợp chất CK3 đã đƣợc phân lập từ các phần chiết điclometan (CKD) và etyl axetat (CKE) dưới dạng bột vô định hình màu đỏ, []
D
21 = −6,75(CHCl3), Rf
= 0,4 (TLC, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 6:1, v:v).
O O
2 1 3
4 5
6 7
8 10 9
11 12
13 14
15
CK3
Phổ hồng ngoại của chất CK3 cho các đỉnh hấp thụ của nhóm cacbonyl lacton (νmax 1733 cm−1) và các liên kết đôi liên hợp (νmax 1607 cm−1).
Công thức phân tử của CK3 đã đƣợc xác định là C15H16O2 dựa trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS chế độ dương (m/z 251,1041, [M + Na]+, C15H16O2Na).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) và HSQC cho thấy trong cấu tạo của chất CK3 có các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân proton của một nhóm metyl bậc hai ởδH 1,31 (3H, d, J = 7,0 Hz, 15-CH3), 2 nhóm metyl vinylic ở δH 1,99 (3H, s, 13-CH3) và 2,25 (3H, s, 14-CH3), 2 proton singlet ở vùng trường thấp ở δH 6,74 (1H, s br, H- 9) và 6,89 (1H, s, H-6), và 2 nhóm metylen sp3 ở δH 1,56 (1H, m, H-3a), 2,15 (1H, m, H-3b), 2,71 (1H, ddd, J = 16,5 Hz, 9,0 Hz, 7,5 Hz, H-2a), và 2,83 (1H, ddd, J
= 16,5 Hz, 7,5 Hz, 6,0 Hz, H-2b), và một nhóm metin sp3 ở δH 3,10 (1H, sextet, J
= 7,0 Hz, H-4).
Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3) xác định sự có mặt của các tín hiệu này qua 15 tín hiệu cacbon-13 bao gồm các tín hiệu của nhóm metyl ở δC 7,59 (q, C- 13), 20,0 (q, C-15), và 24,6 (q, C-14); 2 nhóm metylen ở δC 31,4 (t, C-2) và 33,6 (t, C-3); một nhóm metin ở δC 43,8 (t, C-4); 8 cacbon sp2 của 2 nhóm CH và 6 C không liên kết với hydro ở δC 103,5 (s, C-11), 116,3 (d, C-9), 117,9, (t, C-6), 136,5 (s, C-10), 144,2 (s, C-1), 146,2 (s, C-7), 154,8 (s, C-8), và 156,6 (s, C-5); và một nhóm cacbonyl lacton ở δC 170,6 (s, C-12).
Để xác định cấu trúc của CK3 phổ 1H-1H COSYđã đƣợc ghi (Hình 4.7) cho thấy sự liên kết của nhóm metyl ở δH 1,31 (15-CH3) với 2 nhóm metylen sp3 ở δH 1,56/2,15 (H2-3) và 2,71/2,83 (H2-2) qua nhóm metin ở δH 3,10 (H-4) (mảnh cấu trúc A). Mảnh cấu trúc B đã được xây dựng chủ yếu dựa trên các tương tác HMBC (Hình 4.7). Từ nhóm metyl ở δH 2,25 (14-CH3) các tương tác HMBC của
3 proton nhóm metyl với C-9 (δC 116,3), C-10 (δC 136,5), và C-1 (δC 144,2) cho thấy vị trí liền kề của H-9 với nhóm C-14 metyl. Tiếp đó H-9 (δH 6,74) cho các tương tác HMBC với C-1, C-8 (δC 154,8), và C-7 (δC 146,2) hoàn thành phần phía trên của mảnh cấu trúc B. Phần phía dưới của mảnh cấu trúc B được bắt đầu từ nhóm metyl vòng lacton; nhóm này cho các tương tác với nhóm cacbonyl ở C-12 (δC 170,6), C-11 (δC 103,5), và C-7. Vòng lacton này đƣợc liên kết với nhóm metin sp2 thứ hai ở C-6 (δH 6,89) qua các tương tác HMBC giữa H-6 và C-1, C-5 (δC 156,6), C-8, và C-11. Để ghép nối hai mảnh cấu trúc A và B các tương tác HMBC từ H2-2 và H-4 là rất quan trọng. Các liên kết giữa các mảnh cấu trúc này (đường chấm chấm trên Hình 4.7) đã được xác định từ các tương tác HMBC giữa H2-2 và C-1, C-5, và C-10; và giữa H-4 và C-1, C-5, và C-7.
Hình 4.7. Các tương tác 1H-1H COSY () và HMBC () của CK3
Cuối cùng phổ NOESY của CK3 (Hình 4.8) cho thấy các tương tác NOE giữa H3-14 và H-9 và giữa H-8 và H3-13 và H3-15 khẳng định cho cấu trúc đã đƣợc xác định.
O
O H
H
Hình 4.8. Các tương tác NOESY () quan trọng của CK3
Phổ nhị sắc tròn (CD) của CK3 giống với phổ ECD của (4S)-4-hydroxy- gweicurculacton [119] cho các hiệu ứng Cotton dương ở 257,310 và 374 nm
O
O O
O H
H
A B
khẳng định cùng một sự định hướng không gian của các nhóm metyl ở C-4 của CK3 và (4S)-4-hydroxy-gweicurculacton. Do đó cấu hình tuyệt đối 4R đã đƣợc xác định cho CK3.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR cấu trúc của CK3 đã đƣợc xác định là gweicurculacton. Đây là một cấu trúc sesquitecpen lacton dạng guaianolid hiếm gặp trong thiên nhiên. Cho đến nay cấu trúc chất này mới đƣợc công bố từ các cây Curcuma kwangsiensis [42] và C. wenyujin [108] của Trung Quốc. Trong nghiên cứu này cấu trúc của gweicurculacton đã đƣợc khẳng định chắc chắn và các dữ kiện phổ của gweicurculacton đã đƣợc đƣa ra đầy đủ dựa trên việc phân tích các phổ 2D NMR.
Chất mới CK4 ((1R,4R,5S,8S)-4-Hydroxy-1,8-epoxyguaia-7(11),9-dien- 12,8-olid)
Hợp chất CK4 đã đƣợc phân lập từ các phần chiết điclometan (CKD) và etyl axetat (CKE) dưới dạng tinh thể dạng kim màu trắng, []
D
2 2 = −55,6(CHCl3), Rf = 0,3 (TLC, silica gel, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 1:1, v:v).
O O
14
HO H
O
10 2 1
3 4 5
6 7 8 9
1112
CK4
13 15
Phổ hồng ngoại của chất CK4 cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy (νmax 3465 cm−1), nhóm cacbonyl vòng lacton (νmax 1773 cm−1), và liên kết đôi (νmax 1697 và 1649 cm−1).
Phổ ESI-MS (chế độ dương) của CK4 cho các pic ion giả phân tử ở m/z 263,14 ([M + H]+) và 285,12 ([M + Na]+) cho giả thiết một công thức phân tử C15H18O4 của chất này.
Phổ HR-ESI-MS (chế độ dương) khẳng định công thức phân tử này qua pic ion giả phân tử ở m/z 285,1097 (C15H18O4Na).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) và HSQC cho thấy trong cấu tạo của chất CK4 có các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân proton của một nhóm metyl liên kết với cacbon mang nhóm chứa oxi ởδH 1,32 (3H, s, 15-CH3), 2 nhóm metyl vinylic ở δH 1,80 (3H, d, J = 2,0 Hz, 13-CH3) và 1,89 (3H, s, 14-CH3), 3 nhóm metylen sp3 ở δH 1,86 (1H, m, H-2a), 1,90 (1H, m, H-3a), 2,06 (1H, m, H-3b), 2,20 (1H, m, H- 2b), 2,57 (1H, ddq, J = 17,5 Hz, 9,0 Hz, 2,0 Hz, H-6a), và 2,86 (1H, d, J = 17,5 Hz, H-6b), một nhóm metin sp3 ở δH 2,01 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-5), và một nhóm metin sp2 của nối đôi ở δH 5,75 (1H, q, J = 1,5 Hz, H-9). Các dữ kiện phổ này phù hợp với các tín hiệu cacbon-13 quan sát đƣợc trên các phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3). Trong số 15 tín hiệu cacbon-13 có 3 nhóm metyl ở δC 7,70 (q, C-13), 12,3 (q, C-14), và 25,5 (q, C-15); 3 nhóm metylen ở δC 19,7 (t, C-6), 28,2 (t, C-2), và 39,9 (t, C-3); một nhóm metin ở δC 46,7 (t, C-5); một liên kết đôi thế bốn lần ở δC 118,9 (s, C-11) và 155,4 (s, C-7) và một liên kết đôi thế ba lần ở δC 123,9 (d, C-9) và 148,9 (s, C-10); và một nhóm cacbonyl lacton ở δC 172,5 (s, C-12). Ngoài các tín hiệu trên đáng chú ý có sự xuất hiện của ba cacbon liên kết với oxi ở δC 79,6 (s, C-4), 95,5 (s, C-1), và 108,5 (s, C-8).
Để xác định cấu trúc của CK4 phổ 1H-1H COSY đã đƣợc ghi (Hình 4.9) cho thấy sự liên kết của 2 nhóm metylen ở δH 1,86/2,20 (H2-2) và 1,90/2,06 (H2- 3) và của nhóm metylen ở δH 2,57/2,86 (H2-6) và nhóm metin sp3 ở δH 2,01 (H-5).
Phân tích kỹ các tương tác 1H-1H còn cho thấy có một tương tác allylic giữa H-9 ở δH 5,75 cho tương tác với nhóm C-14 metyl ở δH 1,89. Sau đó các mảnh cấu trúc A và B đã được xây dựng chủ yếu dựa trên các tương tác HMBC (Hình 4.9).
Các tương tác của nhóm metyl ở δH 1,32 (15-CH3) với C-3 (δC 39,9) và C-4 và của H2-2 và H2-3 với C-4 đã hoàn thành mảnh cấu trúc A. Tiếp đó các tương tác HMBC giữa H-5 (δH 2,01) với C-6 (δC 19,7) và C-7 (δC 155,4), giữa H2-6 (δH
2,57/2,86) với C-7, C-11 (δC 118,9), và giữa H3-14 (δH 1,89) với C-1 (δC 95,5) và C-10 (δC 148,9) đã hoàn thành mảnh cấu trúc B. Nhƣ vậy, cầu oxi đã đƣợc xác định là giữa C-1 (δC 95,5) và C-8 (δC 108,5) trên cơ sở tương tác HMBC và độ chuyển dịch hóa học cacbon-13. Hai mảnh cấu trúc A và B đã đƣợc liên kết lại với nhau (các đường chấm chấm trên Hình 4.9) qua các tương tác HMBC giữa H -15 và C-5, H -3 và C-1, và H -2 và C-1 cho cấu trúc của một 4-hydroxy-1,8-
epoxy-guai-7(11),9-dien-12,8-olid. Cấu trúc này phù hợp với các dữ kiện phổ đã được công bố cho các guaianolid tương tự [64].
A B
O
O O
HO O
O O
HO
Hình 4.9. Các tương tác 1H-1H COSY () và HMBC () của CK4
Để xác định cấu hình tương đối của CK4 phổ NOESY đã được ghi (Hình 4.10). Phổ này cho thấy các tương tác NOE giữa H3-15 với H-3 (δH 2,06) và H- 6 (δH 2,86), và giữa H-6 và H3-13. Không có tương tác giữa H-5 và H3-15 khẳng định nhóm C-15 metyl được định hướng . H-5 cho tương tác với H-6 (δH 2,57) và H3-14 xác định cầu epoxit phải được định hướng . Cấu hình Z của liên kết đôi C-9−C-10 cũng được thiết lập qua tương tác NOESY giữa H-9 (δH
5,75) và H3-10 (δH 1,89).
O
O O
HO H
H H H
H
H
Hình 4.10. Các tương tác NOESY () quan trọng của CK4
Do đó, dựa trên các dữ kiện phổ 1D NMR và 2D NMR cấu trúc của CK4 đã đƣợc xác định là 4-hydroxy-1,8-epoxy-5H-guaia-7(11),9-dien-12,8-olid.
Cuối cùng, hóa lập thể tuyệt đối của CK4 đã đƣợc xác định bằng phổ nhị sắc tròn (CD). Hiệu ứng Cotton đặc trƣng của các γ-lacton α,β không no [61] ở 212 nm (+3,83) và 230 nm (−5,83) đã cho thấy cấu hình tuyệt đối S ở C-8. Do đó, cấu trúc lập thể của CK4 đã đƣợc xác định là 1R,4R,5S,8S. Chất CK4 là một hợp chất thiên nhiên mới.
Chất CK5 (2-Oxo-guaia-1(10),3,5,7(11),8-pentaen-12,8-olid)
Hợp chất CK5 đã đƣợc phân lập từ các phần chiết điclometan (CKD) và etyl axetat (CKE) dưới dạng bột vô định hình màu vàng, Rf = 0,4 (TLC, hệ dung môi n-hexan-EtOAc 3:1, v:v).
2 1 3
4 5
6 7
8 10 9
11 12
13 14
15
CK5
O
O O
Phổ ESI-MS (chế độ dương) cho pic ion giả phân tử ở m/z 241,09 ([M + H]+) và phổ ESI-MS (chế độ âm) cho pic ion giả phân tử ở m/z 239,02 ([M − H]¯) cho giả thiết một công thức phân tử C15H12O3 của chất CK5.
Phổ 1H-NMR (CDCl3) và HSQC cho thấy trong cấu tạo của chất CK5 có các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân proton của 3 nhóm metyl vinylic ở δH 2,12 (3H, s, 13-CH3), 2,31 (3H, s, 15-CH3), và 2,70 (3H, s, 14-CH3), 3 proton singlet của các liên kết đôi ở vùng trường thấp ở δH 6,24 (1H, s br, H-3), 6,54 (1H, s br, H-9), và 6,85 (1H, s, H-6).
Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3) xác định sự có mặt của các tín hiệu này qua 15 tín hiệu cacbon-13 bao gồm các tín hiệu của 3 nhóm metyl ở δC 8,40 (q, C- 13), 14,2 (q, C-15), và 22,2 (q, C-14); 10 cacbon sp2 bao gồm 3 nhóm CH ở δC
114,6 (d, C-6), 116,9 (d, C-9), và 132,6 (d, C-3) và 7 C không liên kết với hydro ở δC 116,9 (s, C-9), 116,9 (d, C-11), 127,0 (s, C-1), 142,4 (s, C-7), 144,7 (s, C-10), 145,9 (s, C-4), 156,0 (s, C-8), và 160,7 (s, C-5); một nhóm cacbonyl lacton ở δC 169,2 (s, C-12); và một nhóm carbonyl xeton liên hợp ở δC 195,2 (s, C-2).
Để xác định cấu trúc của CK5 phổ HMBC (Hình 4.11) đã đƣợc phân tích kỹ lƣỡng cho thấy sự liên kết của nhóm metyl ở δH 2,31/δC 14,2 (15-CH3) với nhóm CH vinylic ở δH 6,24/δC 132,6 (H-3/C-3) và các cacbon sp2 không liên kết với hydro ở δH 145,9 (C-4) và 160,2 (C-5) qua các tương tác HMBC giữa H3-15 và C-3, C-4, và C-5. Tiếp đó, H-3 cho tương tác HMBC với nhóm cacbonyl xeton
ở δC 195,0 (C-2) và C-1 (δC 127,0) hoàn thành việc xây dựng cấu tạo của một vòng xiclopentenon. Nhóm metyl ở ở δH 2,70/δC 22,2 (14-CH3) và nhóm CH vinylic ở δH 6,85/δC 114,6 (H-6/C-6) đã cho các tương tác HMBC quan trọng ghép nối vòng xiclopentenon này với hệ vòng tiếp theo giữa H3-14 với C-1, C-10 (δC 144,7), và C-9; và giữa H-6 với C-1 và C-5. Tiếp đó, các nhóm CH vinylic ở δH 6,54/δC116,9 (H-9/C-9) và 6,85/δC 114,6 (H-6/C-6) lại cho các tương tác HMBC lần lƣợt giữa H-9 với C-7 (δC 142,4) và C-8 (δC 156,0) và H-6 với C-8 cho phép ghép nối mảnh cấu trúc trên với một vòng lacton giữa C-12 (δC 169,5) và C-8. Vòng lacton này được xây dựng từ các tương tác HMBC của nhóm metyl ở δH 2,12/δC 8,4 với C-7, C-11 (δC 116,9), và C-12.
O O O
O O O
H H H
Hình 4.11. Các tương tác NOESY () và HMBC () của CK5
Cuối cùng phổ NOESY của CK5 (Hình 4.11) cho thấy các tương tác NOE lần lƣợt giữa H-3 và H3-14, H-6, và H3-13 và giữa H3-15 và H-9 khẳng định cho cấu trúc đã đƣợc xác định.
Trên cơ sở các dữ kiện phổ NMR cấu trúc của CK5 đã đƣợc xác định là 2- oxo-guaia-1(10),3,5,7(11),8-pentaen-12,8-olid. Chất này đã đƣợc lần đầu tiên phân lập từ họ Zingiberaceae, trước đó sesquitecpen ketolacton này đã được phân lập từ cây Taraxacum wallichii (Compositae) [11] và loài san hô biển sâu Placogorgia sp. [60] Dựa trên các tương tác phổ 2D NMR, các dữ kiện phổ 1H- NMR và 13C-NMR của CK5 đã đƣợc gán lại chính xác trong nghiên cứu này.
Kết luận mục 4.3.3
Tổng cộng từ các phần chiết thân rễ cây Nghệ Quảng Tây đã phân lập đƣợc 5 hợp chất có các cấu trúc sesquitecpen lacton, steroit, và axit béo: β-sitosterol (CK1), axit tricosanoic (CK2), gweicurculacton (CK3), (1R,4R,5S,8S)-4-
hydroxy-1,8-epoxyguaia-7(11),9-dien-12,8-olid (CK4), và 2-oxo-guaia- 1(10),3,5,7(11),8-pentaen-12,8-olid (CK5). Tất cả các hợp chất này đã lần đầu tiên phân lập từ thân rễ cây Nghệ Quảng Tây của Việt Nam. Các hợp chất CK2, CK4, và CK5 đã lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài Curcuma kwangsiensis. Chất CK4 là chất mới và CK5 là chất lần đầu tiên đƣợc tìm thấy trong họ thực vật Zingiberaceae. Việc phát hiện đƣợc dãy các guaianoit trong nghiên cứu này là một sự bổ sung lí thú cho các nhóm chất của C. kwangsiensis được tìm thấy trước đó đƣợc đặc trƣng bởi các dẫn xuất của axit benzoic và các điarylheptanoit [57, 58, 59].
Cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ cây Nghệ Quảng Tây đƣợc nêu trong Hình 4.12.
Hình 4.12. Các hợp chất được phân lập từ cây Nghệ Quảng Tây
Một số các sesquitecpen lacton dãy guaianolid đã đƣợc xác định là phân bố trong các phần chiết điclometan và etyl axetat của cây Nghệ Quảng Tây. Mức độ không no của các hợp chất này, ví dụ nhƣ gweicurculacton, cho thấy chúng có thể là các tiền chất có khả năng phản ứng cao cho nhiều dẫn xuất chứa oxi. Bản thân gweicurculacton (CK3) là một hợp chất chỉ xuất hiện rất hạn chế trong các nguồn thực vật [42, 107], tuy nhiên sự xuất hiện của một số chất tương tự như (4S)-4- hydroxy-gweicurculacton từ cây Curcuma wenyujin [119] và sesquitecpen
CK4
O
H O HO
O HO
CH(CH3)2 CH2CH3
H
CK1
CK3
O
O
CK5
O
O O
CH3 (CH2)21 CO2H CK2
ketolacton từ cây Taraxacum wallichii [11] cho thấy có thể có một con đường sinh tổng hợp của một nhóm chất guaianolid thiên nhiên đa nối đôi trong một số thực vật. Cùng với các loài Artemisia, chi Curcuma đã đƣợc biết đến là một nguồn cung cấp các cấu trúc đa dạng của dãy chất guaianolid cho các nghiên cứu hóa học và sinh học [9]. Một nhóm chất rất lý thú đang chờ đợi là mục tiêu cho các nghiên cứu sinh học là nhóm các guaianolid có cầu oxi giữa C-1 và C-8.
Trong nghiên cứu này một thành viên mới của nhóm chất guainolid có cầu oxi C- 1/C-8 đã đƣợc phát hiện là chất (1R,4R,5S,8S)-4-hydroxy-1,8-epoxy-guaia- 7(11),9-dien-12,8-olid (CK4).