3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NGẢI RỪNG (ARTEMISIA ROXBURGHIANA BESS.)
3.2.3 Phân tích các phần chiết lá cây Thanh cao Bắc Bộ bằng sắc ký lớp mỏng
Các điều kiện phân tích sắc ký lớp mỏng các phần chiết từ lá cây Thanh cao Bắc Bộ được trình bày ở Chương II: Phương pháp và Thiết bị nghiên cứu, Mục 2.2.2.
3.2.4 Phân tách các phần chiết lá cây Thanh cao Bắc Bộ 3.2.4.1 Phân tách phần chiết n-hexan (ADH)
Phần chiết n-hexan (ADH) (45 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC, kích thước cột 5 30 cm) trên silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 m). Cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong dung môi n-hexan và mẫu phân tách được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Sau khi mẫu đã đƣợc đƣa lên cột, cột đƣợc rửa giải với hệ dung môi građien n-hexan-axeton với các tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 2:1, và 1:1 (v:v) cho 63 phân đoạn, mỗi phân đoạn 150 ml. Phân tích sắc ký lớp mỏng cho phép gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau thành 12 nhóm phân đoạn, ký hiệu lần lƣợt từ ADH1 đến ADH12.
Quá trình phân tách phần chiết n-hexan (ADH) đƣợc trình bày trong Sơ đồ 6.
PhÇn chiÕt n- hexan (ADH) (45 g)
ADH1 ADH2 4,2 g
ADH3 3,3
ADH4 5,1 g
ADH5 2,7 g
ADH6 2,4 g
ADH7-9 CC, silica gel n-hexan-axeton, gradient
19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1
Rửa bằng MeOH
Rửa bằng n- hexan
ADH10 2,4 g
ADH11-12
AD1 1,646
g
Rửa bằng n- hexan AD2 550
mg
AD3+AD4 4,637 g
ADH5.1- 5.2
ADH5.3- 5.4
ADH5.5 CC, silica gel
n-hexan-EtOAc 15:1, 12:1, 9:1, 6:1
AD5 50 mg
Rửa bằng axeton
ADH5.6- 5.7
Rửa bằng axeton
ADH6.
1
ADH6.2-6.5 CC, silica gel n-hexan-EtOAc 15:1, 12:1, 9:1, 6:1
AD6 460 mg
Rửa bằng MeOH
ADH10.1- 10.2
ADH10.3
ADH10.4 ADH10.5 CC, silica gel n-hexan-EtOAc 4:1, 3:1
1) CC, RP-18 MeOH-H2O
7:3, 8:2, MeOH 2) Mini-C, silica gel n-hexan-axeton 3:1
AD9/AD10 40 mg AD7/AD8
10 mg
Rửa bằng axeton
AD7 11 mg
Sơ đồ 6. Phân tách phần chiết n-hexan (ADH)
Nhóm phân đoạn ADH2 (4,2 g) đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột, sau đó tinh thể nhận đƣợc đƣợc rửa nhiều lần bằng metanol cho calotropoleanyl este (AD1) (1,646 g).
Nhóm phân đoạn ADH3 (3,3 g) đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột, sau đó các tinh thể nhận đƣợc đƣợc rửa nhiều lần bằng n-hexan cho axit nonacosanoic (AD2) (550 mg).
Nhóm phân đoạn ADH4 (5,1 g) đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột, sau đó các tinh thể nhận đƣợc đƣợc rửa nhiều lần bằng n-hexan cho hỗn hợp của 13(18)-oleanen-3β-ol (AD3) và -amyrin (AD4) (4,637 g).
Nhóm phân đoạn ADH5 (2,7 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan- EtOAc 15:1, 12:1, 9:1, và 6:1 cho 21 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 7 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ ADH5.1 - ADH5.7, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn ADH5.3 và ADH5.4 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột, rửa bằng axeton cho chất axit docosanoic (AD5) (50 mg). Nhóm phân đoạn ADH5.6 và ADH5.7 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột n- hexan-EtOAc cho β-sitosterol (AD7) (11 mg).
Nhóm phân đoạn ADH6 (2,4 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan- EtOAc 15:1, 12:1, 9:1, và 6:1 cho 32 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 5 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ ADH6.1 - ADH6.5, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn ADH6.1 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột n- hexan-EtOAc, sau đó đƣợc rửa bằng MeOH cho axit tetracosanoic (AD6) (460 mg).
Nhóm phân đoạn ADH10 (2,4 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan- EtOAc 4:1 và 3:1 cho 60 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 5 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ ADH10.1 - ADH10.5, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng.
Nhóm phân đoạn ADH10.3 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột n-hexan- EtOAc, rửa bằng axeton cho hỗn hợp β-sitosterol (AD7) và stigmasterol (AD8) (5 mg). Nhóm phân đoạn ADH10.4 đƣợc phân tách hai lần bằng sắc ký cột CC trên pha đảo RP-18 với các hệ dung môi MeOH-H2O 7:3 và 8:2 và silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 cho hỗn hợp của 1-O- palmitoylglycerol (AD9) và 1-O-stearoylglycerol (AD10) (40 mg).
3.2.4.2 Phân tách phần chiết điclometan (ADD)
Phần chiết điclometan (ADD) (15 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột thường (CC, kích thước cột 5 30 cm) trên silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 m).
Cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong dung môi n-hexan và mẫu phân tách được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Sau khi mẫu đã đƣợc đƣa lên cột, cột đƣợc rửa giải với hệ dung môi građien n-hexan- axeton với các tỷ lệ 90:1, 49:1, 19:1, 6:1, 3:1, và 1:1 (v:v) cho 80 phân đoạn, mỗi phân đoạn 150 ml. Phân tích sắc ký lớp mỏng cho phép gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau thành 10 nhóm phân đoạn, ký hiệu lần lƣợt từ ADD1 đến ADD10.
Quá trình phân tách phần chiết điclometan (ADD) đƣợc trình bày trong Sơ đồ 7.
Sơ đồ 7. Phân tách phần chiết điclometan (ADD)
Nhóm phân đoạn ADD2 và ADD3 (0,58 g) đƣợc phân tách bằng sắc kí cột nhanh FC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi n-hexan- axeton 29:1, 19:1, và 9:1 cho 5 nhóm phân đoạn, kí hiệu từ ADD2.1 đến ADD2.5, trên cơ sở phân tích sắc kí lớp mỏng. Nhóm phân đoạn ADD2.4 đƣợc kết tinh rồi rửa bằng n-hexan cho 13(18)-oleanen-3-ol (AD3) (10 mg).
PhÇn chiÕt
®iclometan (ADD) (15 g)
ADD1
ADD2-3 0,58 g
ADD4 0,17 g
ADD5 0,2 g
ADD6-7 ADD8 1,54 g CC, silica gel
n-hexan-axeton, gradient 90:1, 49:1, 19:1, 9:1, 6:1, 3:1, 1:1
ADD9 ADD10 0,769 g FC, silica
gel n-hexan- axeton 29:1, 19:1, ADD2.1- 9:1
2.3
ADD2.4 ADD2.5
AD3 10 mg
Rửa bằng n-hexan
ADD4.1 ADD4.3
ADD4.2-4.4 ADD4.5
AD7 10,4 mg
Rửa bằng n-hexan
1) FC, silica gel
n-hexan- axeton
19:1, 9:1 2) Mini-C, silica gel CH2Cl2-EtOAc
70:1, 49:1, 29:1, 19:1, 9:1 3) Mini-C,
silica gel CH2Cl2-EtOAc 90:1, 70:1 AD11 11,8 mg
CC, silica gel CH2Cl2-MeOH
9:1, 7:1 AD13 29,7 mg 1) CC, silica gel n-hexan-EtOAc 7:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1 2) Mini-C,
silica gel n-hexan-EtOAc 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 AD12
44 mg FC, silica
gel n-hexan-
EtOAc 29:1, 19:1, 9:1
Nhóm phân đoạn ADD4 (0,17 g) đƣợc phân tách FC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 29:1, 19:1, và 9:1 cho 5 nhóm phân đoạn, kí hiệu từ ADD4.1 đến ADD4.5, trên cơ sở phân tích sắc kí lớp mỏng.
Các nhóm phân đoạn ADD4.2 và ADD4.4 đƣợc rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (AD7) (10,4 mg).
Nhóm phân đoạn ADD5 (0,2 g) đƣợc phân tách bằng FC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 19:1 và 9:1 cho 4 nhóm phân đoạn, kí hiệu từ ADD5.1 đến ADD5.4, trên cơ sở phân tích sắc kí lớp mỏng. Nhóm phân đoạn ADD5.1 đƣợc tinh chế hai lần bằng Mini-C trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc 70:1, 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, và 4:1 và hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc 90:1 và 70:1 cho axit palmitic (AD11) (11,8 mg).
Nhóm phân đoạn ADD8 (1,54 g) đƣợc phân tách bằng FC trên silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 m) với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 7:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, và 1:1 cho 5 nhóm phân đoạn từ ADD8.1 đến ADD8.5, trên cơ sở phân tích sắc kí lớp mỏng. Nhóm phân đoạn ADD8.3 đƣợc tinh chế hai lần bằng FC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 5:1, 4:1, 3:1, và 2:1 và Mini-C trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m) với hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc 90:1, 70:1, và 15:1, sau đó đƣợc kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi CH2Cl2- axeton cho 6-metoxy-1H-indol-3-metylcacboxylat (AD12) (44 mg).
Nhóm phân đoạn ADD10 (0,769 g) đƣợc phân tách bằng Mini-C trên silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 m) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 9:1 và 7:1 cho β- sitosterol 3-O--D-glucopyranosit (AD13) (29,7 mg).