3.1 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NGẢI RỪNG (ARTEMISIA ROXBURGHIANA BESS.)
3.3.4 Phân tách các phần chiết thân rễ cây Nghệ Quảng Tây
Phần chiết điclometan (CKD) (41,1 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột thường (CC, kích thước cột 5 30 cm) trên silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 m).
Cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong dung môi n-hexan và mẫu phân tách được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Sau khi mẫu đã đƣợc đƣa lên cột, tiến hành rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan- axeton với các tỷ lệ 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1 (v:v) cho 60 phân đoạn, mỗi phân đoạn 150 ml. Phân tích sắc ký lớp mỏng cho phép gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau thành 10 nhóm phân đoạn, ký hiệu lần lƣợt từ CKD1 đến CKD10.
Quá trình phân tách phần chiết điclometan (CKD) đƣợc trình bày ở Sơ đồ 9.
Sơ đồ 9. Phân tách phần chiết điclometan (CKD)
Nhóm phân đoạn CKD3 (1,0 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-axeton 19:1, 9:1, và 6:1 cho 53 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 7 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKD3.1 - CKD3.7, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng.
Nhóm phân đoạn CKD3.3 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột, sau đó các tinh thể nhận đƣợc đƣợc rửa bằng metanol cho β-sitosterol (CK1) (24 mg).
Nhóm phân đoạn CKD4 (1,2 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-axeton 15:1 và 9:1 cho 63 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 8 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKD4.1 - CKD4.8, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKD4.3 đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 15- 40 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-axeton 9:1 cho axit tricosanoic (CK2) (8 mg).
Phần chiết điclometan (CKD) (41,1 g)
CKD1-2 CKD3 1,0 g
CKD4 1,2 g
CKD5 4,0 g CC, silica gel
n-hexan-axeton, gradient
19:1, 9:1, 6:1, 3:1
CK2 8 mg
CKD6-10
CK1 24 mg
CC, silica gel
n-hexan- axeton 19:1, 9:1, 6:1
1) CC, silica gel n-hexan- axeton 15:1, 9:1 2) CC, silica gel n-hexan- axeton 9:1
CKD5.3
CC, silica gel n-hexan-EtOAc- HCOOH
20:10:0,5, 20:19:1
CC, silica gel n-hexan-EtOAc 19:1, 9:1, 6:1, 3:1
CK3 3 mg
Nhóm phân đoạn CKD5 (4,0 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc- HCOOH 20:10:0,5 và 20:19:1 cho 31 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 5 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKD5.1 - CKD5.5, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKD5.3 đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1 cho 53 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 7 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKD5.3.1 - CKD5.3.7, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng.
Nhóm phân đoạn CKD5.3.3 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột cho gweicurculacton (CK3) (3,0 mg)
3.3.4.2 Phân tách phần chiết etyl axetat (CKE)
Phần chiết etyl axetat (CKE) (30 g) được phân tách bằng sắc ký cột thường (CC, kích thước cột 5 30 cm) trên silica gel Merck (cỡ hạt 63-200 m). Cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt trong dung môi n-hexan và mẫu phân tách được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel. Sau khi mẫu đã đƣợc đƣa lên cột, tiến hành rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan-EtOAc- HCOOH với các tỷ lệ 20:5:1, 20:10:1, và 20:19:1 cho 40 phân đoạn, mỗi phân đoạn 150 ml. Phân tích sắc ký lớp mỏng cho phép gộp các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau thành 8 nhóm phân đoạn, ký hiệu lần lƣợt từ CKE1 đến CKE8.
Quá trình phân tách phần chiết etyl axetat (CKE) đƣợc trình bày ở Sơ đồ 10.
Sơ đồ 10. Phân tách phần chiết etyl axetat (CKE)
Nhóm phân đoạn CKE2 (2,1 g) đƣợc phân tách bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 49:1, 19:1, 9:1, và 6:1 cho 19 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 3 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKE2.1 - CK2.3, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp
Phần chiết etyl axetat (CKE) (30 g)
CKE1 CKE2-3 2,1 g
CKE4 CKE5 5,3 g
CKE6 6,53 g
CKE8 5,5 g CC, silica gel
n-hexan-EtOAc-HCOOH, gradient 20:5:1, 20:10:1, 20:19:1
CK1 10 mg
CC, silica gel n-hexan-EtOAc 49:1, 19:1, 9:1, 6:1
2) CC, silica gel n-hexan-EtOAc 19:1, 9:1, 6:1, 3:1
CK3 2 mg
CK5 5 mg
1) CC, RP-18 MeOH-H2O 7:3, 8:2
2) CC, silica gel CH2Cl2-EtOAc 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 1) CC, RP-18 MeOH-H2O 7:3, 8:2
CK5 5 mg
CKE7 3,02 g
2) CC, silica gel CH2Cl2-EtOAc 99:1, 49:1. 29:1, 19:1, 9:1, 6:1 1) CC, RP-18 MeOH-H2O 7:3, 8:2
CK4 7 mg
3) Mini-C, silica gel n-hexan-EtOAc 6:1, 3:1
2) CC, silica gel CH2Cl2-EtOAc 99:1, 49:1. 29:1, 19:1, 9:1, 6:1, 3:1 1) CC, RP-18 MeOH-H2O 7:3, 8:2
CK3 7 mg CC, silica gel n-hexan-EtOAc 19:1, 9:1 CK5 2 mg
Dịch CKE8.1.1
CC, silica gel n-hexan-EtOAc 9:1
CKE6.1.1 CKE6.1.3
CC, silica gel n-hexan-EtOAc 6:1, 3:1 CK4 3 mg
mỏng. Nhóm phân đoạn CKE2.2 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột, sau đó các tinh thể nhận đƣợc đƣợc rửa bằng n-hexan cho β-sitosterol (CK1) (10 mg).
Nhóm phân đoạn CKE5 (5,3 g) đƣợc phân tách lặp lại nhiều lần bằng cột CC trên pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 7:3 và 8:2 cho 3 nhóm phân đoạn ký hiệu từ CKE5.1 - CKE5.3, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng.
Nhóm phân đoạn CKE5.1 (400 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1 cho 102 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 6 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKE5.1.1 - CKE5.1.6, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng.
Nhóm phân đoạn CKE5.1.2 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột cho gweicurculacton (CK3) (2,0 mg). Nhóm phân đoạn CKE5.1.4 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột cho 2-oxo-guaia-1(10),3,5,7(11),8-pentaen-12,8-olid (CK5) (5,0 mg).
Nhóm phân đoạn CKE6 (6,53 g) đƣợc phân tách bằng cột CC trên pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 7:3 và 8:2 cho 3 nhóm phân đoạn ký hiệu từ CKE6.1 - CKE6.3, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKE6.1 (4,8 g) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1 cho 84 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 8 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKE6.1.1 - CKE6.1.8, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKE6.1.1 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột cho 2-oxo-guaia- 1(10),3,5,7(11),8-pentaen-12,8-olid (CK5) (5,0 mg). Nhóm phân đoạn CKE6.1.3 đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 6:1 và 3:1 cho (1R,4R,5S,8S)-4-hydroxy- 1,8-epoxyguaia-7(11),9-dien-12,8-olid (CK4) (3,0 mg).
Nhóm phân đoạn CKE7 (3,02 g) đƣợc phân tách bằng cột CC trên pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 7:3 và 8:2 cho 3 nhóm phân đoạn ký hiệu từ CKE7.1 - CKE7.3, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKE7.1 (2,7 g) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc 99:1, 49:1, 29:1, 19:1, 9:1,
và 6:1 cho 88 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 9 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKE7.1.1 - CKE7.1.9, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKE7.1.3 (66 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột Mini-C trên silica gel Merck (cỡ hạt 15-40 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 6:1 và 3:1 cho (1R,4R,5S,8S)-4-hydroxy-1,8-epoxyguaia-7(11),9-dien-12,8-olid (CK4) (7,0 mg).
Nhóm phân đoạn CKE8 (5,5 g) đƣợc phân tách bằng cột RP-SPE trên pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH-H2O 7:3 và 8:2 cho 3 nhóm phân đoạn ký hiệu từ CKE8.1 - CKE8.3, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKE8.1 (5,2 g) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2-EtOAc 99:1, 49:1, 29:1, 19:1, 9:1, 6:1, và 3:1 cho 69 phân đoạn. Các phân đoạn đƣợc gộp thành 6 nhóm phân đoạn, ký hiệu từ CKE8.1.1 - CKE8.1.6, trên cơ sở các phân tích sắc ký lớp mỏng. Nhóm phân đoạn CKE8.1.1 đƣợc kết tinh trong hệ dung môi chạy cột cho 2-oxo-guaia-1(10),3,5,7(11),8-pentaen-12,8-olid (CK5) (2,0 mg). Phần dịch CKE8.1.1 (178 mg) đƣợc tinh chế bằng sắc ký cột CC trên silica gel Merck (cỡ hạt 40-63 m), rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 19:1 và 9:1 cho gweicurculacton (CK3) (7,0 mg).