4.1 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÂY NGẢI RỪNG ( ARTEMISIA ROXBURGHIANA BESS.)
4.1.2 Chiết và phân tách các phần chiết từ lá cây Ngải rừng
Phần chiết metanol từ lá cây Ngải rừng đƣợc phân bố lần lƣợt giữa H2O và n-hexan, CH2Cl2, và etyl axetat để cho các phần chiết tương ứng n-hexan (ARH), CH2Cl2 (ARD), và etyl axetat (ARE). Các phần chiết này đƣợc phân tách chủ yếu bằng sắc kí cột (CC và FC) gradient (silica gel) với sự sử dụng các kỹ thuật CC (pha đảo RP-18), RP-SPE, và Mini-C (silica gel) trong các bước tinh chế để cho các chất AR1 - AR19. Cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập đã đƣợc xác định bằng các nghiên cứu phổ chủ yếu là IR, MS, và NMR.
Quá trình xử lý mẫu, chiết mẫu và phân tách các phần chiết từ lá cây Ngải rừng đã đƣợc nêu chi tiết trong Mục 3.1, Phần thực nghiệm.
4.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất đƣợc phân lập từ lá cây Ngải rừng
Chất AR1 (3-Oxofriedelan)
Hợp chất AR1 được phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng hạt màu trắng, đ.n.c. 262-265 °C, Rf = 0,70 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 30:1, v:v).
O
H H
1 2
4 3 5
6 7 8 10
13 14 15
16 17 18 19
20 21 22
23 24
25 26
27
28
29 30
AR1
9 11
12
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AR1 cho thấy sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng từ proton của 8 nhóm metyl trong đó có 7 nhóm metyl singlet ở δH 0,73 (3H, s, 24-CH3), 0,87 (3H, s, 25-CH3), 0,95 (3H, s, 29-CH3), 1,0 (3H, s, 30- CH3), 1,01 (3H, s 26-CH3), 1,05 (3H, s 27-CH3), và 1,18 (3H, s, 28-CH3); và một nhóm metyl doublet ở δH 0,88 (3H, d, J = 7,0 Hz, 23-CH3). Hai proton cộng hưởng ở δH 2,24 (1H, m, H-2a) và 2,38 (1H, ddd, J = 11,5 Hz, 7,0 Hz, 2,0 Hz, H- 2b) có các giá trị δ và J cho thấy chúng thuộc về một nhóm metylen liên kết với một nhóm cacbonyl và một nhóm metylen khác, do đó, mảnh cấu trúc – COCH2CH2 đã đƣợc thiết lập. Phổ 13C-NMR và DEPT (CDCl3) của AR1 xác định cấu trúc của một tritecpenoit năm vòng qua sự xuất hiện của 30 tín hiệu cacbon-13 trong đó có một nhóm cacbonyl [δC 213,2 (s)]. Các tín hiệu cộng hưởng khác là của 8 nhóm metyl (CH3) ở δC 6,8 (q), 14,7 (q), 17,9 (q), 18,7 (q), 20,3 (q), 31,8 (q), 32,1 (q), và 35,0 (q); 11 nhóm metylen sp3 (CH2) ở δC 18,2 (t), 22,3 (t), 30,5 (t), 32,4 (t), 32,8 (t), 35,4 (t), 35,6 (t), 36,0 (t), 39,3 (t), 41,3 (t), và 41,5 (t); 4 nhóm metin sp3 (CH) ở δC 42,8 (d), 53,1 (d), 58,2 (d), và 59,3 (d); và 6 cacbon bậc 4 (C) ở δC 28,2 (s), 30,0 (s), 37,5 (s), 38,3 (s), 39,3 (s), và 42,2 (s).
Các dữ kiện phổ NMR này cho giả thiết về một cấu trúc tritecpenoit dãy friedelan của AR1. Nhóm cacbonyl đã đƣợc giả thiết là ở vị trí C-3 xuất phát từ sự sinh tổng hợp các tritecpenoit từ tiền chất squalen-2,3-epoxit. Do đó, trên cơ sở các dữ kiện phổ 1H-NMR và 13C-NMR AR1 đã đƣợc xác định là 3-oxofriedelan (friedelin). Các dữ kiện phổ NMR của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với các dữ kiện phổ đƣợc công bố cho friedelin đƣợc phân lập từ cây Linnania chungii [14].
Chất AR2 (Friedelan-3β-ol)
Hợp chất AR2 đƣợc phân lập trong một hỗn hợp với chất AR1 (3- oxofriedelan) với tỷ lệ khoảng 2:1 (theo phổ 1H-NMR) từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,35 (TLC, silica gel, n- hexan-axeton 30:1, v:v).
H H
HO
1 2
4 3 5
6 7 8 10
13 14 15 16
17 18 19
20 21 22
23 24
25 26
27
28 29
9 11
12
30
AR2
Phổ 1H-NMR của chất AR2 sau khi đã đƣợc loại đi các tín hiệu của chất 3- oxofriedelan (AR1) cho thấy sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân của 7 nhóm metyl singlet ở δH 0,88 (3H, s, 25-CH3), 0,96 (3H, s, 30-CH3), 0,98 (6H, s, 24-CH3, 26-CH3), 1,001 (3H, s, 27-CH3), 1,007 (3H, s, 29-CH3), và 1,18 (3H, s, 28-CH3); và một nhóm metyl doublet ở δH 0,97 (3H, d, J = 7,0 Hz, 23- CH3). Sự phù hợp của dữ kiện phổ 1H-NMR của AR2 với phổ của friedelin (AR1) cho thấy chất này cũng là một tritecpenoit dạng friedelan. Tuy nhiên sự xuất hiện của một tín hiệu cộng hưởng từ proton ở δH 3,75 (1H, s br) cho thấy có sự xuất hiện của một nhóm oxymetin trong cấu tạo của AR2. Vị trí của nhóm oxymetin này đã đƣợc xác định ở C-3 xuất phát từ sự sinh tổng hợp các tritecpenoit từ tiền chất squalen-2,3-epoxit. Hóa lập thể của nhóm 3-hydroxy đã được xác định qua phân tích cấu dạng bền của friedelan-3-ol. Với hằng số tương tác nhỏ (s br) H-3 phải ở vị trí equatorial trong cấu dạng ghế của vòng A và nhóm 3-hydroxy phải được định hướng .
Các dữ kiện phổ 1H-NMR của AR2 hoàn toàn phù hợp với của friedelan- 3β-ol đƣợc phân lập từ cây Flueggea virosa [77], do đó, AR2 đã đƣợc xác định là friedelan-3β-ol (epifriedelanol).
ChÊt míi AR3 (Roxbughianin A)
Hợp chất AR3 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng tinh thể hình kim không màu, đ.n.c. 145-146 oC, []24D = +172(CHCl3), Rf = 0,33 (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 9:1, v:v).
O
O H
O AR3
1 2 3
4 5
6 7
8 10 9
12
13 14
15 11
O
O H
O 219
Phổ hồng ngoại của chất AR3 cho các đỉnh hấp thụ của vòng lacton (max
1764 cm–1) và liên kết đôi (max 1650 cm–1).
Công thức phân tử của AR3 đã đƣợc xác định là C15H20O3 trên cơ sở phân tích phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-TOF-MS chế độ dương (m/z 249,1488, [M + H]+, C15H21O3).
Các dữ kiện phổ 1H-NMR (CDCl3), 13C-NMR/DEPT (CDCl3) và phổ hai chiều HSQC của AR3 cho thấy sự có mặt của 3 nhóm metyl, trong số đó có một nhóm metyl bậc hai [H 1,14 (3H, d, J = 8,0 Hz, 13-CH3) và C 10,1 (q, C-13)], một nhóm metyl liên kết với một cacbon mang oxi [H 1,33 (3H, s, 14-CH3) và C
22,7 (q, C-14)], và một nhóm metyl olefinic [H 1,93 (3H, m, 15-CH3) và C 18,2 (q, C-15)]; 3 nhóm metylen [C 20,4 (t, C-8), 33,5 (t, C-9), và 39,6 (t, C-2)]; 5 nhóm metin [C 39,6 (d, C-11), 49,9 (d, C-7), 52,8 (d, C-5), 82,1 (d, C-6), và 124,7 (d, C-3)]; và 4 cacbon không liên kết với hydro trong số đó có 2 cacbon liên kết với oxi của một vòng oxiran [C 62,5 (s, C-10) và 72,4 (s, C-1)], một cacbon olefinic không liên kết với hydro [C 140,8 (s, C-4)], và một nhóm cacbonyl vòng lacton [C 180,0 (s, C-12)]. Sự xuất hiện của một nối đôi thế ba lần và vòng lacton cũng đã được xác định qua các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 1H-NMR tương ứng
ở các độ chuyển dịch hóa học H 5,56 (1H, s br, H-3) và 4,21 (1H, t, J = 10,5 Hz, H-6). Khi so sánh các phổ NMR của AR3 với phổ của các sesquitecpen lacton C15
dãy guaian thường hay xuất hiện trong chi Artemisia, AR3 đã được xác định là có cấu trúc tương tự của chất sesquitecpen lacton arborescin (219) ([]25D = +60, CHCl3) và chất 1,10-epime của nó [17, 19, 113] ngoại trừ hóa lập thể của nhóm metyl ở C-11 do sự khác biệt của độ chuyển dịch hóa học cacbon-13 ở C-7 (C 49,9), C-11 (C 39,6), C-12 (C 180,0), và C-13 (C 10,1) của các chất này. Để khẳng định cho cấu trúc sesquitecpen lacton này phổ HMBC của AR3 đã đƣợc ghi (Hình 4.1). Dựa trên phổ tương tác xa HMBC, vị trí của nối đối thế ba lần đã đƣợc khẳng định ở các vị trí C-3/C-4 do 3 proton của nhóm metyl ở C-15 (H
1,93) tương tác với C-3 (C 124,7), H2-2 (H 2,11/2,75) tương tác với C-4 (C
140,8), và H-3 (H 5,56) tương tác với C-1 (C 72,4). Vòng oxiran được định vị giữa C-1 và C-10 (C 62,5) do các cacbon này đều nhận các tương tác HMBC từ H-14 (H 1,33). Cuối cùng, sự xuất hiện của vòng lacton và vị trí đóng vòng lacton giữa C-6 và C-12 đã được khẳng định thêm qua các tương tác HMBC giữa H3-13 (H 1,14) và nhóm cacbonyl ở C-12 (C 180,0) và C-7 (C 49,9), và giữa H- 6 (H 4,21) và C-8 (C 20,4). Không có tương tác HMBC từ nhóm oxymetin vòng lacton với các tín hiệu cộng hưởng từ của các proton H2-9 (H 1,94/2,14).
Hóa lập thể ở C-5 (H-5), C-6 (H-6), và C-7 (H-7) có thể đƣợc xác định từ các hằng số tương tác giữa các proton H-5 và H-6 (J5,6 = 10,5 Hz) và H-6 và H- 7 (J6,7 = 10,5 Hz) [13]. Hóa lập thể của H-11 đã đƣợc xác định từ sự so sánh các tín hiệu cacbon-13 ở C-13 của AR3 (H-11, C 10,1) và arborescin (H-11, C 12,3) [19]. Sự xuất hiện các epime H-11 và H-11 là một hiện tƣợng đƣợc ghi nhận cho các guaianolid và sự khác biệt giữa các độ chuyển dịch hóa học proton và cacbon-13 là dấu hiệu để phân biệt các epime ở C-11 [19]. Phổ hai chiều NOESY của AR3 (Hình 4.1) khẳng định vững chắc cho cấu trúc lập thể của AR3 H3-13 (H 1,14) và H-6 (H
qua các tương tác giữa
4,21) và giữa H-5 (H 2,82) và H-7 (H 1,82);
không có tương tác NOE nào xuất hiện giữa H3-
H O
H
13 và H-5/H-7.
Hình 4.1. Các tương tác HMBC () và NOESY () quan trọng của AR3 Trên cơ sở các dữ kiện phổ cấu trúc của AR3 đã đƣợc xác định là 11-epi- arborescin (11H,1,10-epoxyguaia-3-en-12,6-olid) và đƣợc đặt tên thông thường là roxbughianin A. Chất AR3 là một hợp chất thiên nhiên mới.
Chất AR4 (Axit tetracosanoic)
Hợp chất AR4 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,39 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v).
4 2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
OH O
23 3
24 1
AR4
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AR4 xác định sự có mặt của một nhóm ankyl mạch dài qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một nhóm metyl cuối mạch ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 24-CH3) và các nhóm metylen dưới dạng một tín hiệu singlet dải rộng ở δH 1,26 (40H, s br) và 1,61 (2H, quintet, J = 7,0 Hz). Sự có mặt một tín hiệu nhóm metylen ở δH 2,29 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2-CH2) cho thấy nhóm này phải liên kết với một nhóm axit cacboxylic. Các dữ kiện phổ 1H-NMR đã xác định cấu trúc axit béo của AR4. Mạch ankyl đã đƣợc xác định dựa trên phổ 1H-NMR là chứa 22 nhóm CH2. Do đó, AR4 đã đƣợc xác định là axit tetracosanoic.
Chất AR5 (β-Sitosterol)
Hợp chất AR5 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,30 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 6:1, v:v).
HO
CH2CH3
1 2 3
4
5 6 7
8 9 10
11 12
13
14 15
16 17 18
19
20 21
22 23
24 25
26 27
28 29
H
AR5 H
Hợp chất AR5 đã đƣợc nhận dạng là β-sitosterol, một hợp chất phytosterol, trên cơ sở so sánh TLC, co-TLC và phổ IR với chất chuẩn β-sitosterol.
Phổ IR của AR5 cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy (νmax 3468 cm1), nối đôi C=C (νmax 1643 cm1), nhóm CH2 (νmax 1461 cm1), nhóm metyl (νmax1374 cm1), và nhóm CO (νmax 1059 cm1) hoàn toàn trùng với phổ của mẫu chuẩn β- sitosterol của chúng tôi.
Hỗn hợp hai chất AR6 và AR7 [Docosyl p-coumarat (AR6) và Tetracosyl p-coumarat (AR7)]
Hai chất AR6 và AR7 (AR6/AR7) đã đƣợc phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) trong một hỗn hợp khó phân tách dưới dạng bột vô định hình màu trắng, []23D = –2,6 (c = 0,1, pyridin), Rf = 0,48 (TLC, silica gel, CH2Cl2-EtOAc 1:1, v:v).
Phổ IR (film) của hỗn hợp các chất AR6 và AR7 (AR6/AR7) cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy (max 3364 cm1), vòng thơm (max 1651, 1603, 1512, và 1464 cm1), và nhóm este (max 1713 và 1166 cm1).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của AR6/AR7 cho thấy chất này là hỗn hợp các p- coumarat của các ancol béo mạch dài [75, 106]. Phần axit p-coumaric đƣợc xác định qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton ở H 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3, H- 5) và 7,43 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6) của các cặp proton thơm ở các vị trí octo
O
O (CH2)nCH3
HO
AR6 n = 21 AR7 n = 23
2 1
4 3 5
6
7 8
9
1'
và meta với nhóm hydroxy và 7,61 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7) và 6,29 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8) của nối đôi có cấu hình trans giữa vòng thơm và nhóm cacbonyl este. Các dữ kiện phổ 13C-NMR/DEPT(CDCl3) ủng hộ cho cấu trúc này bằng sự xuất hiện của các tín hiệu cacbon-13 của một vòng thơm thế hai lần [H 115,9 (d, C-3, C-5), 127,4 (s, C-1), 129,9 (d, C-2, C-6), và 157,5 (s, C-4)], một nối đôi [H
115,8 (d, C-8) và 144,1 (d, C-7)], và một nhóm cacbonyl este [H 167,5 (s, C-9)]
[106]. Các mạch ankyl dài đã đƣợc xác định là phần ancol béo no của các coumaric este qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton ở H 0,88 (3H, t, J = 6,5 Hz, các nhóm CH3 cuối mạch), 1,26 (n CH2, s br), 1,64 (2H, quintet, J = 7,0 Hz), 1,69 (2H, quintet, J = 7,0 Hz) (các nhóm metylen mạch ankyl), 4,19 (2H, t, J = 7,5 Hz, 1'-CH2) và cacbon-13 ở C 14,1 (q, C-22, C-24), 22,7 (t), 24,7 (t), 26,0 (t), 28,8 (t), 29,1 (t), 29,2 (t), 29,3 (t), 29,4 (t), 29,5 (t), 29,6 (t), 29,61 (t), 29,67 (t), 29,7 (t), và 31,9 (t) (các nhóm metylen mạch ankyl), và 64,7 (t, C-1). Để xác định các nhóm ankyl mạch dài trong hỗn hợp các este này các phổ khối lƣợng (+)-HR-TOF-MS đã đƣợc phân tích. Sự xuất hiện của 2 pic ở m/z 353,5123 và 381,3037 có m/z 28 cho phép giả thiết đây là pic đƣợc tạo thành từ sự phân mảnh các chất AR6 và AR7 qua sự phân cắt liên kết giữa nhóm cacbonyl đƣợc proton hóa trong [M H] và liên kết đôi (ion ROCO+).
Do đó, trên cơ sở các dữ kiện phổ các chất AR6 và AR7 đã đƣợc xác định là tương ứng là các p-coumarat của các ancol docosanol (C22H45OH) và tetracosanol (C24H49OH).
Docosyl p-coumarat đã đƣợc phân lập từ cây Psiadia punctulata [43]. Chất này cùng với tetracosyl p-coumarat cùng là các thành phần của cây A. annua và có các hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển của các tế bào ung thƣ ruột kết HCT116, DNA polymerase và DNA topoisomerase [75].
Chất AR8 (Achillin)
Hợp chất AR8 được phân lập từ phần chiết hexan (ARH) dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c. 145-146 °C, Rf = 0,33 (TLC, silica gel, n-hexan- axeton 3:1, v:v).
O O O
1 2 3
4 5
6 7
8 10 9
11
12 13
AR8
15
14
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AR8 cho thấy sự có mặt của các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân proton của 2 nhóm metyl liên kết với 2 nối đôi ở δH 2,29 (3H, s, 15-CH3) và 2,43 (3H, s, 14-CH3), một nhóm metyl ở dạng doublet [δH
1,13 (3H, d, J = 8,0 Hz), 13-CH3] do liên kết với một nhóm metin ở δH 2,70 (1H, quintet, J = 7,5 Hz, H-11), và một nhóm oxymetin ở δH 3,81 (1H, t, J = 10,0, H- 6). Sự xuất hiện của tín hiệu của một proton nối đôi ở δH 6,16 (1H, br s, H-3) cho thấy trong cấu tạo của hợp chất AR8 có một nối đôi thế ba lần và một nối đối thế bốn lần. Các dữ kiện phổ 1H-NMR của AR8 có nhiều điểm tương tự phổ của một số secquitecpen lacton dãy guaianolid đƣợc phân lập từ chi Artemisia (Asteraceae). Kết luận này đƣợc khẳng định qua phân tích phổ 13C-NMR/DEPT (CDCl3) của AR8 với sự có mặt của 15 cacbon trong đó có 3 nhóm metyl [C 9,9 (q, C-13), 19,8 (q, C-15), và 21,6 (q, C-14)], 2 nhóm metylen [C 23,6 (t, C-8), và 37,6 (t, C-9)], 4 nhóm metin [C 39,4 (d, C-11), 51,9 (d, C-7), 52,9 (d, C-5), và 83,5 (d, C-6)], 2 nối đôi thế [C 131,8 (s, C-1), 135,5 (d, C-3), 152,2 (s, C-10), và 170,2 (s, C-4)], một nhóm cacbonyl vòng lacton [C 178,4 (s, C-12)], và một nhóm xeton liên hợp , không no [C 195,9 (s, C-2)]. Độ chuyển dịch hóa học (δ) và hằng số tương tác (J, s br) của nhóm metin olefinic duy nhất ở δH 6,16 và sự chuyển dịch về phía trường thấp của cacbon olefinic ở δC 170,2 cho thấy nối đôi này phải liên hợp với nhóm xeton cacbonyl ở phần vòng xiclopentan của chất guaianolid này. Một trong 2 nhóm metyl vinylic thuộc vòng xiclopentan này.
Nhóm metyl vinylic thứ hai phải liên kết với nối đôi C-1/C-10 của vòng xicloheptan. Nhóm metyl còn lại ở δH 1,13 là mạch ngoài của một vòng lacton và sự có mặt của hai nhóm metin ở δH 3,41 (H-5) và ở δH 3,81 (H-6) liên kết với nhau với hằng số tương tác J = 10,0 Hz cho thấy vòng lacton này phải gắn với vòng
xicloheptan của khung guaianolid qua các liên kết với C-6 và C-7. Các dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của AR8 hoàn toàn phù hợp với phổ của chất secquitecpen lacton achillin [70].
Achillin đã đƣợc phân lập đầu tiên nhƣ thành phần guainolit chính từ Achillea lanulosa và Achillea milifolium [70]. Sự phân tích cấu dạng của achillin đã từng đƣợc quan tâm nghiên cứu do nhóm metyl ở C-11 có thể đƣợc định hướng và trên vòng lacton. Phổ nhiễu xạ tia X đơn tinh thể đã được áp dụng trong một nghiên cứu cấu dạng trước đó [67] cho thấy sự khác biệt rõ rệt về độ chuyển dịch hóa học proton và cacbon-13 trong các cấu hình có sự định hướng H- 11 (achillin) [δH 1,13; C 9,9 (dung môi CDCl3)] và H-11 (leukodin) [δH 1,29;
C 12,3 (dung môi CDCl3)]. Do đó, dựa trên sự so sánh các dữ kiện phổ NMR hóa lập thể của AR8 đã đƣợc xác định là của achillin.
Chất AR9 (Axit eicosanoic)
Hợp chất AR9 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,39 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v).
4 2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
3
1 OH O AR9
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AR9 xác định sự có mặt của một nhóm ankyl mạch dài qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một nhóm metyl cuối mạch ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 20-CH3) và các nhóm metylen dưới dạng một tín hiệu singlet dải rộng ở δH 1,25 (32H, s br) và 1,63 (2H, quintet, J = 7,0 Hz). Sự có mặt của một tín hiệu nhóm metylen ở δH 2,35 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2-CH2) cho thấy nhóm này phải liên kết với một nhóm axit cacboxylic. Các dữ kiện phổ 1H- NMR đã xác định cấu trúc axit béo của AR9. Mạch ankyl đã đƣợc xác định dựa trên phổ 1H-NMR là chứa 18 nhóm CH2, do đó, AR9 đã đƣợc xác định là axit eicosanoic.
Hỗn hợp hai chất AR10 và AR11 [(1-O-Palmitoylglycerol (AR10) và 1-O- Stearoylglycerol (AR11)]
Hai chất AR10 và AR11 (AR10/AR11) đƣợc phân lập từ phần chiết n- hexan (ARH) trong một hỗn hợp khó phân tách dưới dạng bột vô định hình màu trắng, []23D = –20,7 (c = 0,1, pyridin), Rf = 0,48 (TLC, silica gel, CH2Cl2-EtOAc 1:1, v:v).
Phổ IR (film) của hỗn hợp các chất AR10 và AR11 cho các đỉnh hấp thụ của nhóm hydroxy (max 3393 cm1), và nhóm este (1735 và 1261 cm1).
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của AR10/AR11 cho thấy rõ các tín hiệu của các phần glycerol và axit béo của một hỗn hợp các glycerol monoeste không đối xứng [33]. Các tín hiệu của phần axit béo đƣợc chỉ ra bằng các tín hiệu đặc trƣng ở H
0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz) của các nhóm metyl cuối mạch, 1,29 (n CH2, s br) của các mạch béo của các nhóm metylen, và 1,63 (2H, quintet, J = 7,0 Hz) và 2,35 (2H, t, J = 7,0 Hz) của các nhóm metylen liên tiếp liền kề với nhóm cacbonyl este. Sự xuất hiện của cụm 2 nhóm oxymetylen ở H 3,6 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 5,5 Hz, H-3a)/3,69 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 3,5 Hz, H-3b) và 4,15 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 6,0 Hz, H-1a)/4,2 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,5 Hz, H-1b) và một nhóm oxymetin ở
H 3,93 (1H, quintet, J = 4,5 Hz, H-2) là của phần glycerol đã đƣợc este hóa ở C- 1. Một cách tương ứng, các tín hiệu cộng hưởng từ proton của H2-1 được chuyển dịch về phía trường thấp hơn so với các tín hiệu cộng hưởng từ proton của H2-3.
Các dữ kiện phổ 13C-NMR (DEPT) (CDCl3) hoàn toàn phù hợp với giả thiết trên với sự quan sát đƣợc các tín hiệu của phần axit ở C 14,1 (q), 22,7 (t), 24,9 (t), 29,1 (t), 29,3 (t), 29,4 (t), 29,5 (t), 29,6 (t), 29,66 (t), 29,7 (t), 31,9 (t), 34,2 (t), và 174,3 (s). Các tín hiệu cacbon-13 của phần glycerol cộng hưởng ở C 63,4 (t, C- 3), 65,2 (t, C-2), và 70,3 (d, C-1). Để xác định các axit béo trong thành phần của hỗn hợp các glycerol 1-monoeste các phổ (+)- và ()-TOF-ESI-MS của AR10/AR11 đã đƣợc ghi. Trên phổ ()-TOF-ESI-MS đáng chú ý là sự xuất hiện
H2C O HC OH H2C OH
O
(CH2)nCH3
AR10 n = 14 AR11 n = 16
2 1
3 1'
2 pic giả ion phân tử ở m/z 255,1887 và 283,2553 tương ứng với các pic ([M H]) của axit palmitic C16H32O2 và axit stearic C18H36O2.
Do đó, các chất AR10 và AR11 đã được xác định tương ứng là 1-O- palmitoylglycerol và 1-O-stearoylglycerol.
Do độ quay cực của AR10/AR11 là []23D –20,7 (pyridin) nên các glycerol đƣợc cho là có cấu hình 2R dựa trên sự so sánh độ quay cực của AR10/AR11 với độ quay cực của các glycerol monoeste tương tự đã được công bố [86]. Các glycerol 1-monoeste có cấu hình 2S cho các độ quay cực dương, ví dụ như (2S)-1- O-heptatriacontanoyl glycerol có giá trị độ quay cực là []26D +7,5 (c = 0,2, pyridin) [86].
Chất AR12 (Axit palmitic)
Hợp chất AR12 đã được phân lập từ phần chiết n-hexan (ARH) dưới dạng bột vô định hình màu trắng, Rf = 0,39 (TLC, silica gel, n-hexan-EtOAc 4:1, v:v).
4 2 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
3
1 OH AR12 O
Phổ 1H-NMR (CDCl3) của chất AR12 xác định sự có mặt của một nhóm ankyl mạch dài qua các tín hiệu cộng hưởng từ proton của một nhóm metyl cuối mạch ở δH 0,88 (3H, t, J = 7,0 Hz, 16-CH3) và các nhóm metylen dưới dạng một tín hiệu singlet dải rộng ở δH 1,25 (24H, s br) và 1,60 (2H, quintet, J = 7,0 Hz). Sự có mặt một tín hiệu nhóm metylen ở δH 2,34 (2H, t, J = 7,5 Hz, 2-CH2) cho thấy nhóm này phải liên kết với một nhóm axit cacboxylic. Các dữ kiện phổ 1H-NMR đã xác định cấu trúc axit béo của AR12. Mạch ankyl đã đƣợc xác định dựa trên phổ 1H-NMR là chứa 14 nhóm CH2, do đó, AR12 đã đƣợc xác định là axit palmitic.
Axit palmitic xuất hiện phổ biến trong các thực vật dưới dạng tự do hoặc este trong các dầu thực vật và mỡ có nguồn gốc động vật. Axit palmitic thường đƣợc sản xuất từ dầu cọ.
ChÊt AR13 (23(Z)-Cycloart-23-en-3,25-diol)