Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của nguồn gen IRRDB’81 bằng chỉ thị isozyme và chỉ thị RAPD
2.2.1. Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của nguồn gen IRRDB’81 bằng chỉ thị isozyme
2.2.1.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu gồm ứng dụng chỉ thị isozyme vào đánh giá mức độ đa dạng di truyền của nguồn gen IRRDB’81 so với các nguồn gen khác, đồng thời phân tích quan hệ di truyền giữa các nhóm và tiểu nhóm địa lý thuộc vùng sưu tập của nguồn gen IRRDB’81.
Cơ sở lý luận: các tính trạng kiểu hình (hình thái, sinh trưởng, năng suất, v.v…) chịu nhiều ảnh hưởng của môi trường nên không phản ánh chính xác sự đa dạng di truyền trong khi các enzyme là sản phẩm trực tiếp của gen ít bị ảnh hưởng bởi môi trường và có tính đa hình lớn phản ảnh chính xác hơn sự đa dạng di truyền của nguồn gen IRRDB’81.
2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu
Tổng số gồm 204 mẫu giống thuộc các nguồn gen cao su khác nhau đang có tại VCS đã được đưa vào phân tích isozyme gồm (bảng 2.2):
Nguồn di truyền IRRDB’81: gồm 162 mẫu giống chọn ngẫu nhiên, mẫu lá của các mẫu giống dùng trong nghiên cứu này được thu thập trên các chồi ghép từ vườn nhân lưu trữ quỹ gen (SNLK86) tại Trung tâm Lai Khê, VCS.
Nguồn di truyền Wickham (W) gồm 24 dòng vô tính có xuất xứ từ các nước vùng Đông Nam Á (Indonesia, Malaysia và Sri Lanka). Mẫu lá được thu thập trên các chồi ghép từ vườn nhân lưu trữ quỹ gen (SNLK86), và vườn nhân giống gốc tại Trung tâm Lai Khê, VCS.
Nguồn di truyền Wickham x Amazone (WA): gồm 18 dòng vô tính lai giữa nguồn di truyền Wickham với nguồn di truyền cao su thuộc vùng nguyên quán
Amazone (được sưu tập trước nguồn IRRDB’81), có xuất xứ từ Nam Mỹ, Đông Nam Á và các dòng vô tính được tạo tuyển trong nước. Mẫu lá được thu thập trên các chồi ghép từ vườn nhân lưu trữ quỹ gen (SNLK86), và vườn nhân giống gốc tại Trung tâm Lai Khê, VCS.
Danh sách chi tiết các mẫu giống nghiên cứu chỉ thị isozyme ở phụ lục 3.
Phương pháp nghiên cứu
Tổng số 12 chỉ thị isozyme đã được sử dụng trong nghiên cứu (bảng 2.3.).
Quá trình lấy mẫu và phân tích isozyme được thực hiện theo qui trình đã được phát triển bởi CIRAD (Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développment) cho cây cao su (Leconte, 1997). Các lá chét ở giai đoạn B (màu nâu đỏ) của từng mẫu giống được thu thập trên vườn, được giữ lạnh bằng thùng trữ lạnh với nước đá và được chuyển nhanh về phòng thí nghiệm tại VCS (Bến Cát, Bình Dương) để ly trích enzyme trong vòng dưới 2 giờ sau khi lấy mẫu.
Các isozyme được ly trích bằng cách nghiền mẫu lá cao su trong dung dịch đệm chiết xuất (tris 70 mM + cysteine 10 mM, pH=7,4), mỗi cối nghiền gồm:
- 20 mg PVPP (polyvinyl polypyrrolidone) - 50 mg lá cao su tươi
- 0,5 – 0,6 ml dung dịch đệm chiết xuất
Dịch ly trích được lọc và đưa đi điện di ngang trên gel tinh bột 12% (Sigma) với dung dịch đệm gel TH6 (tris-histidin pH=6) hoặc TH8 (tris-histidin pH=8) và dung dịch đệm điện cực TC6 (tris-citrate pH=6) hoặc TC8(tris-citrate pH=8).
- Gel TH6 cho các chỉ thị isozyme: MDH, PGI, AAP, LAP, DIA, PGD - Gel TH8 cho các chỉ thị isozyme: EST, ADH, ICD, PGM, GOT, SKD
Cường độ dòng điện cho quá trình điện di được đặt ở 50 mA, hiệu thế ban đầu khoảng 80 – 90 V tăng đến 120 – 150 V và giảm xuống khoảng 110 V ở cuối kỳ. Thời gian điện di cần thiết khoảng 5 – 6 giờ. Gel sau đó được cắt và nhuộm màu theo qui trình phù hợp cho từng isozyme (Leconte, 1997). Các vạch điện di được
mã hóa bằng 1 cặp số tương ứng với một cặp alen. Kết quả điện di được nhị phân hoá thành các loại alen khác nhau tại mỗi locus isozyme. Số lượng locus hiện diện và số lượng alen trên từng locus được thống kê theo nhóm di truyền để đánh giá sự đa dạng di truyền.
Phân tích số liệu: thống kê số lượng alen theo locus isozyme theo từng nguồn di truyền, nhóm và tiểu nhóm địa lý cho nguồn gen IRRDB’81, phân tích phương sai phân tử (AMOVA, Analysis of molecular variance), khoảng cách di truyền Nei (1972), biểu đồ khoảng cách di truyền được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted pair group method with arithmatic mean) cho các nguồn gen, các nhóm và tiểu nhóm địa lý trong nguồn gen IRRDB’81 với các phần mềm: Excel, NTSYSPC 2.1 (Rohlf, 2000) và GenAlEx 6.1. (Peakall và ctv, 2006).
Bảng 2.2. Số lượng các mẫu giống trong nghiên cứu chỉ thị isozyme
Nguồn gen Vùng địa lý Tiểu vùng địa lý K ý hiệu Số mẫu giống
IRRDB’81 Acre (AC) 60
Assis-Brasil AC/AB 2
Brasileia AC/B 9
Feijo AC/F 15
Sena Madureira AC/S 21
Tarauaca AC/T 10
Xapuri AC/X 3
Mato Grosso (MT) 33
Aracatuba MT/A 9
Cartriquacu MT/C 8
Itanba MT/IT 13
Vila Bela MT/VB 3
Rondonia (RO) 69
Ariquemes RO/A 20
Calama RO/C 25
Jaru RO/J 10
Jiparana RO/JP 12
Ouro Preto RO/OP 1
Pimenta Bueno RO/PB 1
Wickham (W) 24
Wickham-Amazone (WA) 18
Bảng 2.3. Các chỉ thị isozyme trong nghiên cứu và số alen đa hình
TT Isozyme Tên đầy đủ Số alen/locus*
1 MDH malate dehydrogenase 4
2 PGI phospho glucose isomerase 4
3 AAP alanyl amino peptidase 2
4 LAP leucine amino peptidase 7
5 EST esterase 6
6 DIA diaphorase 6
7 ADH alcohol dehydrogenase 4
8 ICD isocitrate dehydrogenase 4
9 PGD phosphogluconase dehydrogenase 3
10 PGM phosphoglucomutase 5
11 GOT glutamate oxaloacetate transaminase 3
12 SKD shikimate acid 7
* Theo bảng chuẩn của CIRAD (Leconte, 1997)