Chương 2 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của nguồn gen IRRDB’81 bằng chỉ thị isozyme và chỉ thị RAPD
2.2.2. Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền của nguồn gen IRRDB’81 bằng chỉ thị RAPD
2.2.2.1. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu gồm ứng dụng chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphic DNA) để đánh giá mức độ đa dạng di truyền cho nguồn gen IRRDB’81 so với các nguồn gen khác, đồng thời phân nhóm quan hệ di truyền các nguồn gen cũng như các nhóm và tiểu nhóm địa lý trong nguồn gen IRRDB’81.
Cơ sở lý luận: RAPD là một chỉ thị DNA vì vậy không bị ảnh hưởng của yếu tố môi trường do đó sẽ phản ảnh chính xác hơn sự đa dạng di truyền của nguồn gen nghiên cứu.
2.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu
Tổng số có 250 mẫu giống đại diện cho các nguồn gen khác nhau đã được đưa vào nghiên cứu (bảng 2.4 và phụ lục 4).
- Nguồn gen IRRDB’81: gồm 150 mẫu giống, mỗi nhóm địa lý (Acre, Mato Grosso và Rondonia) có 50 mẫu giống.
- Nguồn gen Wickham (W): gồm 50 dòng vô tính có nguồn gốc từ Châu Phi, Đông Nam Á và các dòng vô tính được tạo tuyển trong nước.
- Nguồn gen Wickham x Amazone (WA): gồm 50 dòng vô tính có bố là các mẫu giống Amazone được sưu tập trước nguồn gen IRRDB’81 có nguồn gốc từ Nam Mỹ, Đông Nam Á và các dòng vô tính được tạo tuyển trong nước.
Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu
Trên cơ sở kết quả 13 đoạn mồi đã được báo cáo có độ đa hình cao trên cây cao su theo nghiên cứu của Venkatachalam và ctv (2001, 2002) và Zewei và ctv (2005), Trần Thanh (2007) đã khảo sát độ đa hình của 13 đoạn mồi này trên tập đoàn giống cao su tại Việt Nam và xác định có 8 đoạn mồi có độ đa hình cao hơn.
Dựa trên các nghiên cứu trên, 8 đoạn mồi có độ đa hình cao đã được sử dụng trong đề tài này (bảng 2.5).
Bảng 2.4. Số lượng các mẫu giống trong nghiên cứu chỉ thị RAPD
Nguồn gen Vùng địa lý Tiểu vùng địa lý Ký hiệu Số mẫu giống
IRRDB’81
Acre AC 50
Assis-brasil AC/AB 5
Brasileia AC/B 10
Feijo AC/F 7
Sena Madureira AC/S 17
Tarauaca AC/T 6
Xapuri AC/X 5
Mato Grosso MT 50
Aracatuba MT/A 13
Cartriquacu MT/C 15
Itanba MT/IT 16
Vila Bela MT/VB 6
Rondonia RO 50
Ariquemes RO/A 8
Calama RO/C 10
Costa Marques RO/CM 6
Jaru RO/J 8
Jiparana RO/JP 8
Ouro Preto RO/OP 5
Pimenta Bueno RO/PB 5
Wickham W 50
Wickham-Amazone WA 50
Bảng 2.5. Danh sách các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu chỉ thị RAPD
TT Tên đoạn mồi Chuỗi trình tự
1 OPA-04 5'- AATCGGGCTG -3'
2 OPA-16 5'- AGCCAGCGAA -3'
3 OPA-18 5'- AGGTGACCGT -3'
4 OPB-12 5'- CCTTGACGCA -3'
5 OPC-05 5'- GATGACCGCC -3'
6 P-10 5'- TCCCGCCTAC -3'
7 A-18 5'- AGGTGACCGT -3'
8 O-4 5'- AAGTCCGCTC -3'
Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu và tách chiết DNA
Mẫu lá tươi ở giai đoạn màu tím đồng được thu thập trên vườn lưu trữ quỹ gen và vườn tuyển non cho các mẫu giống. Mẫu lá tươi của các mẫu giống được lưu giữ ở -20oC, sau đó được rửa sạch và lau khô trước khi cắt lấy 0,1g phần thịt lá cho vào cối nghiền với nitơ lỏng. Bột lá sau đó sẽ được ly trích DNA bằng QIAGEN DNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN, Đức) theo qui trình khuyến cáo bởi nhà cung cấp bộ kit đã được cải tiến một số bước nhằm thu được DNA tổng số có chất lượng phù hợp với yêu cầu phân tích (phụ lục 5). Sau khi ly trích, DNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và xác định hàm lượng ADN bằng cách đo độ hấp thụ quang phổ. Sau đó, nồng độ DNA được điều chỉnh ở mức 25ng/L và được giữ ở -20C cho đến khi sử dụng.
Phân tích RAPD
Thành phần của phản ứng PCR bao gồm PCR buffer 1X (200 mM Tris-HCl pH 8,4, 500 mM KCl), 2,0 mM MgCl2, 200 M dNTP's, 0,8 M đoạn mồi, 1,5 U Taq ADN polymerase (Promega, USA.) và 50 ng ADN khuôn. Thể tích cuối của mỗi phản ứng là 25l. Phản ứng được thực hiện bằng máy luân nhiệt MyCycler (BIO-RAD, USA).
Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho các đoạn mồi
Đoạn mồi
Nhiệt độ biến
tính (oC)
Chu kỳ nhiệt (oC) 1 chu kỳ
biến tính ban đầu (3 phút)
35 chu kỳ 1 chu kỳ
kéo dài cuối cùng (3 phút) Biến tính
(30 giây)
Bắt cặp (45 giây)
Kéo dài (2 phút)
A-18 32 94 94 30 72 72
O-4 32 94 94 30 72 72
OPA-04 32 94 94 30 72 72
OPA-16 32 94 94 30 72 72
OPA-18 32 94 94 30 72 72
OPB-12 32 94 94 30 72 72
OPC-05 34 94 94 32 72 72
P-10 34 94 94 32 72 72
Giữ mẫu ở 4oC
Sau khi khuếch đại, sản phẩm RAPD – PCR có thể được điện di ngay hoặc bảo quản ở 40C trong vài ngày hoặc ở -200C trong thời gian lâu hơn. Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TBE 1X, nhuộm màu gel bằng ethidium bromide (1àg/mL). Thang 100 bp ADN (Promega, USA) được sử dụng; thang gồm 11 mảnh dải đôi ADN có kích thước 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 và 1.500 bp (Phụ lục 5). Gel điện di được chụp bằng máy GelDoc-ItTM Imaging System (UVP, Mỹ) với tia UV và kích thước băng trên gel được ước lượng bằng phần mềm Launch VisionWorksLS (Phụ lục 5). Phân tích chỉ thị RAPD được thực hiện tại phòng thí nghiệm VCS, Bến Cát, Bình Dương.
Phân tích số liệu: thống kê số lượng băng khuyếch đại, tỷ lệ băng đa hình theo từng nguồn di truyền, nhóm và tiểu nhóm địa lý cho nguồn gen IRRDB’81, phân tích giá trị dị hợp tử trung bình, chỉ số đa dạng gen Shannon, hệ số đồng dạng di truyền, khoảng cách di truyền Nei (Nei, 1972 ; Nei và Li, 1979), phương sai phân tử AMOVA (Analysis of molecular variance), biểu đồ khoảng cách di truyền được xây dựng theo phương pháp UPGMA (Unweighted pair group method with arithmatic mean) cho các nguồn gen, các nhóm và tiểu nhóm địa lý trong nguồn gen IRRDB’81 với các phần mềm: Excel, NTSYSPC 2.1 (Rohlf, 2000) và GenAlEx 6.1. (Peakall và ctv, 2006), Popgen 1.31 (Yeh và Boyle, 1997; Yeh và ctv, 1999).