PHẦN 3:ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng
3.4.3.1. Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy đến khối lượng khô không đổi 3.4.3.2. Phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl
a. Định lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl Nguyên tắc:
- Quá trình gồm 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn vô cơ hóa: ở nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H2SO4 thì các hợp chất có chứa các hợp chất nitơ sẽ bị phân hủy và bị oxi hóa đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành ammoniac (NH3) rồi kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate.
+ Giai đoạn cất đạm: sau khi vô cơ hóa hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc đều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang.
Tính toán:
- Lập đồ thị chuẩn của các ống nghiệm từ 2 đến 6 trị số mật độ quang của các ống nghiệm từ 2 đến 6 bằng trị số mật độ quang của các ống nghiệm từ 2 đến 6 đã được đo ở trên trừ mật độ quang của ống số 1. Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo ta loại bỏ NH3 bằng NaOH.
(NH4)2SO4 + NaOH→Na2SO4 + NH3 + H2O
- Lượng NH3 sinh ra được thu lại bằng máy parmas và được dẫn đến erlen có chứa một lượng thừa H2SO4 đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH3 sẽ tác dụng với H2SO4 chuyển thành (NH4)2SO4.
NH3 + H2SO4→(NH4)2SO4 + H2SO4 dư
- Sau đó chuẩn độ lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu.
NaOH + H2SO4 → Na2SO4 + H2O
b. Định lượng nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc: dùng các dung môi thích hợp để tách tất cả các dạng nitơ phi protein. Tuy nhiên trong dịch triết còn lần một số loại protein. Vì vậy cần dùng các chất kết tủa để tách riêng phần protein hòa tan trong quá trình tách.
c. Định lượng protein có trong nguyên liệu bằng phương pháp Kjeldahl.
Có thể tiến hành theo 2 cách:
- Cách 1: xác định trực tiếp
+ Xác định hàm lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết quả nhân với 6,25.
Protein = Nitơprotein x 6,25 - Cách 2: xác định gián tiếp
Nitơtổng số = Nitơprotein + Nitơphi protein
Ta xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi protein và sau đó là nitơ protein.
Nitơprotein = Nitơtổng số - Nitơphi protein
Từ đó ta được: Protein = Nitơprotein x 6,25
3.4.3.3. Phân tích hàm lượng gluxit (đường khử) theo phương pháp Bertrand
Trong môi trường kiềm các đường khử dễ dàng khử đồng II thành đồng I theo phản ứng Fehling. Kết tủa đồng I oxit có màu đỏ gạch, có khả năng khử muối Fe3+ thành Fe2+ trong môi trường acid.
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 → 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
Fe2+ sinh ra có tính khử lại tác dụng với KMnO4 là chất oxy hóa nên dùng KMnO4 để chuẩn độ Fe2+ trong môi trường acid:
10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 5Fe2(SO4)3 + 8H2O Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được lượng Cu2O và từ đó tính
được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 và đường khử của Bertrand.
Chuẩn bị hóa chất:
- Thuốc thử Fehling = Fehling A + Fehling B tỉ lệ 1:1 - Fehling A: 40g CuSO4.5H2O trong 1 lít nước cất
- Fehling B: 20g natri kali tartrate (C4H4O6NaK.4H2O) và 150g NaOH trong 1lít nước cất.
- Dung dịch Fe2(SO4)3 trong H2SO4: 50g Fe2(SO4)3 và 20g H2SO4 thêm nước đến 1 lít.
+ Dung dịch KMnO4 1/30N.
+ Dung dịch acetate chì 30%
+ Dung dịch Na2SO4 bão hoà
Hàm lượng đường khử tính theo công thức:
X = a.V.100/ V1.m.1000 Trong đó :
- X: hàm lượng đường khử tính theo %
- a: số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số mL KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích trừ đi số mL KMnO4 1/30N dùng để chuẩn độ mẫu không.
- V: thể tích pha loãng mẫu (100ml)
- V1: thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử - m: lượng mẫu đem phân tích
- 1000: hệ số đổi gam thành mg 3.4.3.4. Phân tích hàm lượng lipid
Nguyên tắc: Dùng axit clohydric hòa tan mẫu để giải phóng toàn bộ chất béo hấp thụ và liên kết trong mẫu, sau đó chiết chất béo bằng dung môi hữu cơ - Chuẩn bị dụng cụ, nguyên liệu và hóa chất:
+ Bộ cất soclet.
+ Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ.
+ Bếp cách thủy điều chỉnh được nhiệt độ.
+ Cân phân tích chính xác đến 0,0001g.
+ Cân kỹ thuật chính xác đến 0,1g.
+ Phễu chiết dung tích 250ml.
+ Giấy lọc cuốn thành ống.
+ Etepetrol có nhiệt độ sôi 40 - 600C.
+ Ete etylic có nhiệt độ sôi 30 - 500C hoặc tetracacbon clorua.
+ Canxi sunfat không chứa peroxit hoặc natri sunfat khan hay cát đã tinh chế.
+ Canxi clorua khan.
+ Axit clohydric 1/2.
+ Giấy quỳ.
+ Cốc đốt, dung tích 250ml.
Cách tiến hành:
- Trộn thật đều mẫu, cân 5 - 10g mẫu trên cân phân tích chính xác đến 0,001g, chuyển toàn bộ mẫu vào cốc dung tích 250ml, tráng cốc cân bằng nước cất đun sôi (khoảng 30ml). Cho 50ml axit clohydric 1/2 vào, thêm đá bọt, đậy cốc bằng mặt kính đồng hồ.
- Đun cách thủy trong 15 phút, khuấy kỹ mẫu trên bếp điện đến sôi và để sôi nhẹ trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc.
- Tráng kính đồng hồ bằng nước sôi vào cốc, đem lọc nóng qua giấy lọc xếp cạnh có chứa khoảng 5g cát tinh chế. Tráng kỹ cốc bằng nước cất nóng và rửa kỹ phần cặn lọc bằng nước cất nóng.
- Để giấy lọc và cặn đến ráo rồi đặt lên mặt kính đồng hồ và sấy ở 1050C trong 1 giờ.
- Lấy giấy lọc có cặn gấp lại cho vào ống chiết của bộ cất Soclet. Dùng bông thấm ete lau kỹ mặt kính đồng hồ và cho bông đó vào cùng giấy lọc để chiết. Tiếp tục cất như điều 1.5.
- Xác định một mẫu trắng.
Hàm lượng lipit (X) tính bằng % theo công thức
100 ). (
)
( 1 2 3 4
m
m m m
X = m − − −
Trong đó:
- m: lượng cân (g)
- m1: khối lượng bình hứng có chất béo (g) - m2: khối lượng bình không (g)
- m3: khối lượng bình hứng mẫu trắng sau khi cất (g) - m4: khối lượng bình không của mẫu trắng (g)
Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định song song tính chính xác đến 0,01%.
Chênh lệch kết quả giữa 2 lần xác định không lớn hơn 0,02%.