2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CHẤT CẤM BETA-AGONIST TRONG CHĂN NUÔI
2.6.1. Các phương pháp phát hiện và định lượng beta-agonist
Giống nhƣ các chất tồn dƣ, ô nhiễm khác, trên thực tế có thể sử dụng hai nhóm phương pháp phân tích để xây dựng chiến lược kiểm soát. Trong đó, các phương pháp định tính hoặc các phương pháp bán định lượng đặc hiệu chỉ dùng để phát hiện các mẫu nghi ngờ, còn phương pháp phân tích khẳng định để nhận diện và định lƣợng chính xác nồng độ chất tồn dƣ.
2.6.1.1. Phương pháp sàng lọc (screening)
Các phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hoặc một nhóm chất ở một nồng độ quan tâm hay để phân biệt giữa các mẫu đạt và không đạt yêu cầu vệ sinh. Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc thường được tiến hành trước khi định lượng chính xác.
+ Phương pháp sàng lọc (screening) định tính
Phương pháp sàng lọc hay được sử dụng nhiều trong phân tích các chất
thuộc nhóm beta-agonist là các kit phát hiện nhanh dạng receptor hoặc miễn dịch đặc hiệu. Có thể thử nhanh từng chất hoặc thử nhanh cả nhóm beta-agonist.
Các kít thử nhanh có nhiều ƣu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện, trang thiết bị thông thường, tương đối nhạy và đặc hiệu, thời gian thực hiện nhanh, chi phí thấp. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn có những nhược điểm, cụ thể:
Một số kít thử nhanh đọc kết quả bằng màu, do đó nếu màu gần giống nhau thì rất khó phân biệt. Không định lƣợng đƣợc hoặc chỉ bán định lƣợng chất tồn dƣ.
Bị ảnh hưởng của một số chất có trong mẫu như các hormone có thể cho kết quả dương tính giả.
Chẳng hạn: kít phát hiện nhanh nhóm beta-agonist do công ty Biopanda, Anh Quốc sản xuất. Trên cơ sở nguyên lý miễn dịch sắc ký cạnh tranh, kít có thể cho kết quả trong 5-10 phút. Mỗi test (cassette) đều có một giếng thử S (sample) với cửa sổ phản ứng T (test) và kiểm chứng C (control). S để nhận mẫu thử, T biểu thị kết quả dương-âm tính và C làm nội kiểm chứng. Theo công bố của nhà sản xuất kít có khả năng phát hiện cả ba chất (clenbuterol, ractopamine và salbutamol) đều ở ngưỡng tương đối thấp (10 ppb).
Hình 2.4. Kít miễn dịch thử nhanh chất cấm
Nguồn: Biopanda Reagent (2017) Sau khi mẫu được xử lý một cách đơn giản theo hướng dẫn được nhỏ vào giếng nhận mẫu, chờ và đọc kết quả trong 5-10 phút. Kết quả có thể xảy ra một trong ba trường hợp sau:
Dương tính: nếu chỉ xuất hiện vạch nội kiểm chứng (C). Biểu thị nồng độ tối thiểu của clenbuterol, ractopamine và salbutamol là từ ngƣỡng phát hiện trở lên.
Âm tính: nếu xuất hiện cả hai vạch thử nghiệm (T) và kiểm chứng (C).
Không giá trị: nếu không xuất hiện vạch kiểm chứng (C), cho dù có xuất hiện vạch thử nghiệm (T).
Hình 2.5. Nguyên tắc đọc kết quả thử nghiệm khi dùng kit thử nhanh Nguồn: Phạm Kim Đăng (2017) Với cùng nguyên lý miễn dịch cạnh tranh, một kít phát hiện nhanh khác đƣợc sản xuất bởi Công ty Thời đại Xanh có ngƣỡng phát hiện theo công bố là rất thấp. Trên mẫu thịt, nước tiểu, có thể phát hiện ở ngưỡng 1 ppb đối với clenbuterol; 2 ppb đối với ractopamine và 3 ppb đối với salbutamol. Mẫu thức ăn chăn nuôi có thể phát hiện clenbuterol, ractopamine và salbutamol ở nồng độ 10 ppb. Độ chính xác 95 %; giá trị dự đoán dương tính tối thiểu 90 %;
và giá trị dự đoán âm tính tối thiểu 95 %.
Hình 2.6. Cách thử và đọc kết quả khi thử bằng kít thử nhanh
Nguồn: Phạm Kim Đăng (2017) + Sàng lọc có khả năng bán định lƣợng
Các phương pháp dạng này vừa nhằm mục đích nhận diện nhóm beta- agonist vừa có khả năng bán định lượng, gồm có các phương pháp:
- ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay).
Các phương pháp sàng lọc nhóm này có độ đặc hiệu cao, cho kết quả tương đối nhanh, có thể sử dụng các loại mẫu khác nhau, có thể bán định lượng.
Tuy nhiên, giá thành của các kít này lại cao, có thể có phản ứng chéo dẫn đến dương tính giả, hơn nữa còn đòi hỏi kỹ thuật viên được đào tạo với trình độ chuyên môn cao.
Chẳng hạn: kít Immuno BETA-AGONIST ELISA KIT do công ty Thời đại xanh, Việt Nam sản xuất theo phương pháp sắc ký miễn dịch cạnh tranh, dùng để phát hiện bán định lượng beta-agonist trong mẫu thịt, nước tiểu và thức ăn chăn nuôi. Theo công bố kèm theo kít, giới hạn phát hiện của kít là 0,1 ppb. Trong đó, thịt có thể phát hiện ở 0,4 ppb, nước tiểu ở 0,1 ppb, thức ăn chăn nuôi ở 5 ppb.
Tỷ lệ thu hồi là 90 ±15%. Khả năng phản ứng chéo:
- Clenbuterol 100%
- Salbutamol 105%
- Tulobuterol 116,5%
- Pirbuterol 150%
- Carbuterol 191,5%
- Terbutaline 46,8%
- Mabuterol 40,1%
- Methyl-Clenbuterol 29,4%
- Cimaterol 6,4%
- Orciprenaline <7,8%
Trên thị trường còn nhiều hãng sản xuất kít ELISA kiểm tra beta-agonist khác nhƣ Randox ELISA beta-agonist test kit, Euro-Diagnostica test kit và Ridascreen beta-agonist test kit. Bên cạnh các tham số của kít do các hãng sản xuất công bố còn có các nghiên cứu thẩm định phương pháp của nhiều nhóm tác giả khác nhƣ Ponniah et al. (2004).
2.6.1.2. Phương pháp khẳng định và định luợng chính xác
Mục đích của phương pháp khẳng định là định lượng và định danh chính xác chất tồn dƣ. Với những chất cấm sử dụng nhƣ nhóm beta-agonist, việc kiểm soát tồn dư thường không qua bước sàng lọc mà có thể tiến hành ngay bằng phân tích khẳng định chủ yếu sử dụng các phương pháp lý hoá, gồm:
- Phương pháp sắc ký với nguyên tắc phân tách các hợp chất dựa vào sự phân bố khác nhau giữa hai pha tĩnh và động. Pha tĩnh (rắn hoặc lỏng) ở trong
cột, pha động đi qua nhờ mao quản.
Có hai loại sắc ký là sắc ký khí (GC – Gas Chromatography) và sắc ký lỏng (LC – Liquid Chromatography). Hiện nay, sắc ký khí và sắc ký lỏng thường đƣợc gắn với đầu dò khối phổ (LC-MS) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS). Ngoài ra còn có các dạng sắc ký khác nhƣ: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC - Hight Performance Thin Layer Chromatography), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - Hight Performance Liquid Chromatography) và sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography).
Các phương pháp lý hoá rất nhạy và nhận diện được rõ ràng, định lượng đƣợc chính xác hóa chất tồn dƣ và rất nhạy. Tuy nhiên còn có một số nhƣợc điểm: Đòi hỏi quy trình rất phức tạp (từ khâu chuẩn bị, tách chiết, làm sạch mẫu, đến khâu vận hành máy), thiết bị rất đắt tiền, yêu cầu kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao.