Đánh giá năng lực và kinh nghiệm thực hiện phân tích chất cấm beta- agonist trong các nền thức ăn chăn nuôi, nước tiểu động vật của 15 phòng thử nghiệm thực hiện trong giai đoạn 2011-2015 đƣợc thể hiện bằng kết quả thống kê số lƣợng mẫu phân tích của từng nền mẫu và từng chất thuộc nhóm beta-agonist.
Kết quả tổng hợp cho thấy: Số lƣợng mẫu thử nghiệm chất cấm beta-agonist trong giai đoạn 2011- 2015 của các phòng thí nghiệm rất khác nhau, theo đó có sự không đồng đều về số mẫu đƣợc yêu cầu phân tích tại các đơn vị thử nghiệm (bảng 4.1). Có đơn vị không nhận đƣợc mẫu thử nghiệm trong năm (PTN có mã số 11), trong khi một số phòng thử nghiệm (có mã số 2, số 7, số 14 và số 15) lại nhận đƣợc số lƣợng mẫu đề nghị phân tích khá lớn.
Lý do có sự khác nhau về số lƣợng mẫu nhận đƣợc của các đơn vị là do địa bàn phân bố các phòng thử nghiệm. Các phòng thử nghiệm ở gần trung tâm TP. Hà Nội, TP. HCM, TP. Cần Thơ hoặc gần các địa phương có ngành chăn nuôi lợn phát triển (Đồng Nai, Bình Dương, Vĩnh Long, Hà Nam, Hưng Yên) luôn có số lƣợng mẫu nhận đƣợc nhiều hơn so với các phòng thử nghiệm ở xa trung tâm nhƣ phòng thử nghiệm ở Thái Nguyên, phòng thử nghiệm ở Quảng Ninh. Tuy nhiên, ngay tại trung tâm Hà Nội và TP Hồ Chí Minh cũng có những phòng thử nghiệm có số lƣợng mẫu rất hạn chế, có thể do các phòng thử nghiệm này mới xây dựng được phương pháp, mới được cơ quan quản lý chỉ định nên chƣa đƣợc khách hàng biết đến. Phần lớn các phòng thử nghiệm nhận số lƣợng mẫu phân tích lớn đều sử dụng thiết bị chính là sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ để thử nghiệm, có hai phòng thử nghiệm sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ và một phòng thử nghiệm sử dụng HPLC.
Bảng 4.1. Kết quả điều tra số lượng mẫu thử nghiệm và phương pháp phân tích chất cấm nhóm beta - agonist của 15 phòng thử nghiệm
giai đoạn 2011-2015 (mẫu/năm)
Mã PTN Mẫu thức ăn chăn nuôi Mẫu nước tiểu Phương pháp phân tích
SAL CLEN RAC SAL CLEN RAC
1 35 6 3 16 15 16 LC-MS/MS
2 123 100 120 120 123 154 LC-MS/MS
3 60 10 10 32 25 20 LC-MS/MS
4 12 13 13 6 5 2 GC-MS
5 51 41 40 0 0 0 LC-MS/MS
6 74 12 12 15 18 20 LC-MS/MS
7 251 50 65 164 156 164 LC-MS/MS
8 12 0 0 0 0 0 LC-MS/MS
9 47 81 17 52 0 0 LC-MS/MS
10 27 51 26 20 0 10 GC-MS
11 0 0 0 0 0 0 LC-MS/MS
12 15 16 10 0 4 0 LC-MS/MS
13 5 7 5 0 0 0 HPLC
14 12 12 10 215 200 210 LC-MS/MS
15 68 15 25 373 105 135 LC-MS/MS
Để đánh giá chất lƣợng cũng nhƣ tính cập nhật và sự phù hợp thông lệ quốc tế của các phương pháp phân tích sử dụng tại các phòng thử nghiệm, ngoài xem xét hồ sơ tự thẩm định phương pháp, đề tài còn tổng hợp các tài liệu mà các phòng thử nghiệm tham khảo để xây dựng phương pháp phân tích. Tài liệu tham khảo mà các phòng thử nghiệm sử dụng để xây dựng phương pháp phân tích định lượng chất cấm beta-agonist trong TACN và nước tiểu động vật rất đa dạng. Kết quả bảng 4.2 cho thấy 100% phòng thử nghiệm (15/15 PTN) xây dựng phương pháp phân tích nội bộ đều sử dụng các tài liệu tham khảo về phân tích chất cấm từ các tạp chí khoa học hoặc khuyến cáo của hãng thiết bị. Sự đa dạng này cũng phù hợp với xu hướng chung của thế giới. Thực tế cho thấy các phòng thí nghiệm tham chiếu trên thế giới cũng sử dụng các phương pháp khác nhau, đa số các phương pháp sử dụng được chuẩn hoá từ các phương pháp do các hãng cung cấp thiết bị khuyến cáo hoặc các phương pháp đã được công bố trên các tạp chí khoa học quốc tế.
Bảng 4.2. Tài liệu tham khảo để xây dựng phương pháp nội bộ phân tích beta-agonist của các phòng thử nghiệm
Mã
PTN Tên tài liệu tham khảo
1, 14 CLG-AGON1.02 Identification of Beta-Agonists by HPLC-MS/MS.
Journal of Chromatographic Science, Vol. 47, April 2009 2 Application note 5990-4180EN (Agilent)
3 Ref.Vertified TIP SPO, 2001, UKY Gluck Equine Rsch Ctr (CLEN) 4 Vertified TIP SPO, 2002, UKY Gluck Equine Rsch Ctr (Ratopamine) 5 Vertified TIP SPO, 1996, PETR (Sabutamol)
6
Determination of CLEN in meat samples with Elisa and GC-MS method. 1st Annual International Interdisciplinary Conference, AIIC 2013 24-26 April, Azores Portugal Proceedings
7
Determination of Beta –Agonists in Bovine Urine: Comparison of two extraction/ clean-up procedures of high-resolution gas chromatography – mass spectrometry analysis.
8, 15
Analysis of Beta-Agonist in animal feeds by liquid chromatography – tandem mass spectrometry and health risk assessment. International conference on agricultural, ecological and medical sciences
9 Journal of Chromatography A, 880, 69-83, 2000.
10 USDA (2012), CLG-AGON1.03.
11
Determination of B-Agolists in Pork with SPE Cleanup and LC-MS/MS detection using Agilent bond Elut PCX soid phase extration cartridge, Agilen Poroshell 120 column and Liquid chromatography –tandem spectrometry/Agilent technologies.2011
12 Method of test for veterinary drug residues in food –Test of multiresidue analysis of b - Agonist, Meiho Institute University SOP No. 0949424412.
13 Agonists in feed by LCMS Agilent 5990-4180 EN
Kết quả tổng hợp các phương pháp và thông số kỹ thuật các phương pháp phân tích chất cấm beta –agonist (CLEN, SAL, RAC) trong TACN và nước tiểu lợn từ số liệu điều tra của các phòng thử nghiệm cho thấy có sự khác biệt về phương pháp phân tích không chỉ ở qui trình xử lý mẫu, điều kiện thiết bị mà còn có sự khác biệt về khả năng phát hiện cũng nhƣ khả năng định lƣợng (bảng 4.3 và bảng 4.4).
Kết quả điều tra về quy trình xử lý mẫu trong quá trình thử nghiệm chất cấm beta –agonist trong TACN và nước tiểu lợn của các phòng thử nghiệm được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi và nước tiểu lợn để phân tích chất cấm beta -agonist của các phòng thử nghiệm
Mã PTN Tóm tắt quy trình xử lý mẫu TLTK*
1
Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng methanol đã axit hoá. Dịch chiết đƣợc làm khô. Hoà cặn với Diclometan và axit HCl. Trung hoà axit bằng NaOH.
1
2 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng ACN:HCl 0,1N (1:9); làm
sạch bằng cột SCX. 2
3 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch đệm KH2PO4 0,1M
(pH=6), làm sạch bằng cột SCX. 3
4 Beta -agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng đệm KH2PO4 0,1M (pH=6),
làm sạch với cột SCX. Dẫn xuất với BSTFA:TMCS (99:1). 4 5
Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng acetonitril 5% FA và hỗn hợp muối MgSO4 + NaCl+ Natri citrat; Làm sạch bằng d-SPE (MgSO4 + C18 + PSA)
5
6 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng axit phosphoric 1%, pH= 2,3;
làm sạch bằng cột Plexa PCX 6
7 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng ACN/H2O (1/1); làm sạch
bằng cột SCX 7
8 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng đệm acetate pH 5,2; loại
protein bằng HClO4; làm sạch bằng cột SCX 8
9 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch đệm KH2PO4 0,1M
(pH=6), làm sạch bằng cột SCX 9
10
Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch đệm KH2PO4 0,1M (pH=6), làm sạch bằng cột SCX. Dịch chiết đƣợc dẫn xuất với BSTFA:TMS
10
11 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch đệm KH2PO4,
0,1M (pH=6), làm sạch bằng cột SCX 11
12 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch axit phosphoric
1%, làm sạch bằng cột SCX 12
13 Beta -Agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng hỗn hợp dung môi
Acetonitril/ isopropanol (4/1), muối NaCl, Na2SO4 và MgSO4 13 14 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch đệm natri acetate
0,2M, làm sạch bằng cột HLB 13
15 Beta-agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch ACN:H2O (50:50),
làm sạch bằng cột SCX 13
* Số thứ tự TLTK (tài liệu tham khảo) tương ứng với số TT tại Bảng 4.2
Kết quả điều tra về điều kiện chạy máy và kết quả thẩm định phương pháp thử của các phòng thử nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Điều kiện thiết bị và khả năng phát hiện, định lƣợng beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi và nước tiểu lợn của các phương pháp phân tích
tại các phòng thử nghiệm Mã
PTN Điều kiện thiết bị
Kết quả thẩm định phương pháp (ppb)
LOD LOQ
1
Cột Poroshell 120 EC-C18 (2,1x 100 mm x 2,7m) Pha động: Amonium acetat 2mM:ACN
Thiết bị: LC-MS/MS
0,5 1,5
2
Cột C18 Agilent Eclipse Plus (2,1x 50 mm x 1,8 m) Pha động: ACN (0,1% FA): Nước (0,1% FA)
Thiết bị: LC-MS/MS
1,0 3,0
3
Cột C18 (2,1 x150 mm x 3,5m) Pha động: Nước (0,1% FA):ACN Thiết bị: LC-MS/MS
1,0 3,0
4
Cột DB-5MS (0,25 x 30 m x 0,25m) Chế độ: SCAN/SIM
Thiết bị: GC-MS
2,0TA 1,0NT
5,0TA 3,0NT
5
Cột Agilent C18 (2,1 x 150 mm x 3,5m) Pha động: Nước (0,1% FA):MeOH Thiết bị: LC-MS/MS
1,0 3,0
6
Cột Agilent Zorbax C18 (2,1 x 150 mm x 3,5m) Pha động: Nước (0,1% FA):MeOH (0,1% FA) Thiết bị: LC-MS/MS
1,0TA 0,3NT
3,0TA 1,0NT
7
Cột Agilent C18 (4,6 x 50 mm x 5,0m) Pha động: Nước (0,1% FA):ACN
Thiết bị: LC-MS/MS
1,0 3,0
8
Cột Waters BEH C18 (2,1 x 50 mm x 1,7m) Pha động: MeOH: Nước (0,1% FA)
Thiết bị: LC-MS/MS
2,0 6,0
9
Cột Agilent C18 (4,6 x100 mm x 3,5m) Pha động: Nước (0,1% FA):ACN
Thiết bị: LC-MS/MS
0,2 0,6
Mã
PTN Điều kiện thiết bị
Kết quả thẩm định phương pháp (ppb)
LOD LOQ
10
Cột HP-5a (0,25 mm x 30m x 0,25μm) Chế độ SIM/SCAN
Thiết bị: GC-MS
1,0 3,0
11
Cột Agilent C18 (4,6 x 150 mm x 3,5m) Pha động: Nước (0,1% FA): ACN
Thiết bị: LC-MS/MS
0,5 1,5
12
Cột Sciences C18
Pha động Methanol (0,1% FA) + Nước (0,1% FA) Detector: MS/MS
Thiết bị: LC-MS/MS
2,0 5,0
13
Cột ODS
Pha động: Nước: ACN (4:1) Thiết bị: HPLC-DAD
2,65rac 10,93rac
14
Cột Agilent C18 (4,6 x 150 mm, 3,5m) Pha động: Nước (0,1% FA): MeOH Thiết bị: LC-MS/MS
0,3 1,0
15
Cột Inertsil ODS-4 (4,6 x150 mm x 3m)
Pha động: FA (0,1%), amonium acetate 10 mM MeOH Thiết bị: LC-MS/MS
1,0 3,0
TA: Thức ăn chăn nuôi; NT: Nước tiểu, rac: Ractopamin
Kết quả bảng 4.3 và bảng 4.4 cho thấy về quy trình chiết mẫu, phần lớn các phòng thử nghiệm sử dụng nguyên lý beta –agonist trong mẫu đƣợc chiết bằng dung dịch đệm phốt phát và làm sạch qua cột chiết pha rắn SPE. Có 13/15 phòng thử nghiệm phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng (LC), 2/15 phòng thử nghiệm phân tích bằng kỹ thuật sắc ký khí (GC) trong đó 14/15 phòng thử nghiệm sử dụng đầu dò khối phổ (detector MS), 1/15 phòng thử nghiệm sử dụng đầu dò dãy diod (detector DAD). Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) trong mẫu TACN nằm trong khoảng 0,5 – 10 ppb; trong mẫu nước tiểu nằm trong khoảng 0,5 – 2 ppb (Bảng 4.4). Theo thông tƣ số 01/2016/TT-BNNPTNT về sửa đổi, bổ sung một số điều của Thông tƣ số 57/2012/TT-BNNPTNT (Thông tƣ 57/2012/TT-BNNPTNT, 2012) ngày 07/11/2012 quy định việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất cấm thuộc nhóm beta –agonist trong chăn nuôi,
mẫu TACN được coi là dương tính khi có kết quả phân tích định lượng 10 ppb, mẫu nước tiểu lợn 2ppb. Như vậy, các phòng thử nghiệm nêu trên đều có năng lực về thiết bị và phương pháp phân tích chất cấm nhóm beta–agonist trong mẫu TACN và nước tiểu lợn phù hợp với quy định trong Thông tư này
Từ các phương pháp điều tra được trình bày trong bảng 4.3 và bảng 4.4, Hội đồng chuyên môn đã đánh giá các thông số kỹ thuật và quy trình phân tích của các phòng thử nghiệm và đưa ra kết luận rằng: Phương pháp của phòng thử nghiệm số 3, số 7, số 9, số 11 là tương tự nhau về quy trình phân tích, thiết bị và điều kiện thiết bị, theo đó thiết bị đƣợc sử dụng là LC-MS/MS, cột sắc ký Agilent C18 (4,6 x150 mm x 3,5m), pha động là nước (0,1% Formic Axit):ACN. Các phương pháp còn lại không có sự tương đồng về thiết bị, hóa chất, cột....
Tại Việt Nam, hiện nay chưa có tiêu chuẩn quốc gia (TCVN) về phương pháp phân tích định lượng các chất cấm beta –agonist trong TACN và nước tiểu lợn. Tuy nhiên, năm 2016 Bộ Khoa học và Công nghệ đã công bố TCVN 11294:2016 để xác định dƣ lƣợng beta-agonist (CLEN, RAC, SAL) trong thịt gia súc bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng 2 lần. Về nguyên tắc của phương pháp là dư lượng CLEN, RAC, SAL tự do trong mẫu thử được chiết bằng hỗn hợp axetonitrile và isopropanol. Sử dụng các muối natri clorua, natri sulfat và magie sulfat để tủa protein và loại nước có trong dịch chiết. Dịch chiết được bay hơi dung môi đến khô, phần cặn được hòa tan bằng dung dịch nước chứa 10 % axetonitril, sau đó làm sạch bằng n-hexan. Phần dịch chiết sau khi làm sạch đƣợc phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần để xác định CLEN, RAC, SAL. Giới hạn định lượng của phương phỏp là CLEN 0,1 à/kg, SAL 2,5 àg/kg và RAC là 5 àg/kg. Tuy nhiờn, do đặc tớnh nền mẫu khỏc nhau nên phương pháp này không thể áp dụng trực tiếp để xác định beta-agonist trên nền mẫu TACN và nước tiểu vật nuôi.
Vì vậy, đối với mẫu TACN và nước tiểu vật nuôi, các phòng thử nghiệm đã phải tự xây dựng phương pháp thử nội bộ dựa theo tham khảo các bài báo khoa học theo điều kiện thiết bị và năng lực kỹ thuật của mình. Nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Hà và cs (2016) cũng đã công bố phương pháp phân tích chất cấm beta –agonist trong TACN bằng sắc ký lỏng hiệu năng 2 lần khối phổ sử dụng cột C18 (2,1x100 mm x 1,7àm) và pha động là nước (0,1%FA): ACN cho độ chính xác cao (đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời
gian phân tích nhanh). Phương pháp này cũng tương đồng với phương pháp mà Hội đồng chuyên môn đề xuất ở trên.
Dựa vào kết quả điều tra nêu trên và ý kiến đánh giá của Hội đồng chuyên môn, một phương pháp phân tích chung được đề xuất để phân tích chất cấm beta–agonist (CLEN, SAL, RAC) trong TACN và nước tiểu lợn bằng thiết bị phân tích LC-MS/MS. Mẫu thử đƣợc chiết bằng đệm photphate. Mẫu chiết đƣợc ly tâm lạnh, lọc, làm sạch bằng cách qua cột MCX (đối với mẫu TACN), cột PCX (đối với mẫu nước tiểu gia súc). Các beta–agonist được định lượng bằng hệ thống LC-MS/MS, cột sắc ký Agilent C18 (4,6 x150 mm x 3,5m), pha động là nước (0,1% Formic Axit):ACN). Các nội chuẩn được sử dụng gồm CLEN-D9, SAL-D3, RAC-D3.
Tóm tắt quy trình phân tích: (i) Mẫu thử (1,0 g đối với mẫu là thức ăn chăn nuôi; 2,0 ml đối với mẫu nước tiểu được thêm dung dịch nội chuẩn hỗn hợp); (ii) Mẫu chuẩn trắng (không chứa beta - agonist), (iii) Mẫu kiểm soát (mẫu được bổ sung chuẩn hỗn hợp và nội chuẩn hỗn hợp). Đường chuẩn được xây dựng, đối với mẫu thức ăn chăn nuôi thêm chuẩn từng chất ở nồng độ: 2,5, 5, 10, 15, 20, 25 g/l cùng với nồng độ nội chuẩn 10 g/l; mẫu nước tiểu thêm chuẩn ở các nồng độ: 0, 1.5, 2, 4, 6, 8 g/l cùng với nồng độ nội chuẩn 8 g/l. Thực hiện phép đo theo thứ tự tiêm nhƣ sau: Tiêm dung môi; Tiêm dung dịch chuẩn có nồng độ xác định; Tiêm mẫu thêm chuẩn; Tiêm dung môi; Tiêm mẫu trắng; Tiêm mẫu kiểm soát; Tiêm dung môi; Tiêm mẫu thử; Tiêm dung môi; Tiêm dung dịch chuẩn có nồng độ xác định; Tiêm dung môi. Kết quả thử nghiệm đảm bảo khi hệ số hồi qui tuyến tính của đường chuẩn R2 ≥ 0,99; Độ thu hồi của hai mẫu kiểm soát phải nằm trong giới hạn cho phép 80-110%. Các mẫu có hàm lƣợng nhỏ hơn LOD theo từng nền mẫu đƣợc trả kết quả là không phát hiện. Sau khi thẩm định đã xác định đƣợc giới hạn phát hiện (LOD) cho mỗi chất SAL, RAC, CLEN) trong TACN là 2,5 àg/kg, nước tiểu gia sỳc là 0,5àg/kg.