2.7.1 Khái niệm biến dị soma
Ban đầu nuôi cấy mô đƣợc sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây đồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ƣu tú. Tuy nhiên, với các công trình nghiên cứu trên nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế, người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lƣợng và cấu trúc nhiễm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gen... Các biến dị này đƣợc truyền lại cho cây khi tái sinh.
Nuôi cấy mô gây ra các biến dị trong cây tái sinh, đƣợc gọi là biến dị soma (somaclonal variation) (Larkin and Scowcroft, 1981). Biến dị soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gen trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Nhƣ vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng. Quan trọng hơn, theo Skirvin et al. (1993) và Jain (1998), nó có thể tạo ra các biến dị bền vững về mặt di truyền, rất có ích trong cải thiện cây trồng, tương tự như được cảm ứng bởi tác nhân gây đột biến vật lý và hóa học. Theo Jain (2001) thì biến dị soma thì không thể dự đoán đƣợc trong tự nhiên, và có thể có cả tính di truyền và không di truyền (biểu sinh).
2.7.2 Cơ sở của biến dị soma
Sự xuất hiện biến dị soma liên quan đến các đột biến điểm, sự tái tổ hợp và sắp xếp lại nhiễm sắc thể, sự methyl hóa DNA, số bản sao trình tự bị thay đổi, các nguyên tố chuyển vị, và dường như bị ảnh hưởng bởi kiểu gen, loại mẫu cấy, môi trường nuôi cấy và tuổi của cây cho (Jain, 1998). Tùy thuộc loại cây, số lần cấy chuyền là một yếu tố cũng có thể dẫn đến biến dị nhiều hơn. Hệ thống nuôi cấy mô tự bản thân nó hoạt động nhƣ một hệ thống gây đột biến bởi vì các tế bào trải qua sự tổn thương khi phân lập, và có thể tái lập chương trình trong quá trình tái sinh dưới điều kiện rất khác với điều kiện tự nhiên. Sự tái lập chương trình hay tái lập cấu trúc có thể tạo ra rất nhiều biến dị biểu sinh trong cây tái sinh (Jain, 2000).
Biến dị soma ở mức độ nhiễm sắc thể
Biến dị nhiễm sắc thể đã đƣợc ghi nhận ở một vài loài cây cấy mô và thế hệ con cháu của nó (Ahloowalia, 1976; Duncan, 1997; Gupta, 1998). Mẫu cấy có số nhiễm sắc thể cao và có bội thể (ploidy) cao có nhiều biến dị hơn loài có số nhiễm sắc thể thấp và ploidy thấp (Creissen and Karp, 1985). Các kiểm soát chu kỳ tế bào bình thường (có vai trò ngăn cản sự phân chia tế bào trước khi sự sao chép DNA hoàn thành) bị gián đoạn bởi nuôi cấy, kết quả là tạo ra sự đứt đoạn nhiễm sắc thể (Phillips et al., 1994). Nhiễm sắc thể bị đứt và hậu quả của nó (sự thiếu, nhân đôi, đảo đoạn và chuyển đoạn) gây ra sự sai khác (Duncan, 1997).
Nguyên tố chuyển vị (Transposable elements)
Hoạt động của nguyên tố chuyển vị là một dạng biến dị nữa đƣợc cảm ứng trong nuôi cấy mô. Gen chuyển vị có thể đƣợc hoạt hóa trong nuôi cấy mô dẫn đến biến dị soma đƣợc đề nghị lần đầu tiên bởi Ahloowalia (1985).
Các dòng đột biến từ cây tái sinh tự nó không biểu hiện ra là đột biến không bền vững hay đột biến chất lượng. Chỉ có một vài trường hợp đột biến không bền vững hay một phần nào đó của đột biến trong thế hệ con cháu đƣợc báo cáo. Groose and Bingham (1986) đã xác định đột biến màu hoa không bền vững, hoạt động giống nhƣ đột biến đƣợc cảm ứng bởi nguyên tố chuyển vị.
Tuy nhiên, các ngụ ý về nguyên tố chuyển vị vẫn chƣa đƣợc chứng minh.
Kaeppler et al. (1998) đề nghị rằng các nguyên tố chuyển vị có thể chỉ chiếm một tỉ lệ tương đối nhỏ của biến dị trong nuôi cấy mô.
Biến dị phân tử
Những thay đổi kiểu hình ở cây đƣợc tái sinh và thế hệ sau của chúng là những đột biến chất lƣợng, là những đột biến gen đơn đƣợc di truyền theo định luật Mendel và là gen lặn. Một số đột biến gen đơn nhƣ thiếu diệp lục tố, lùn, tính trạng hạt, cấu trúc sinh sản, lá hoại tử ở bắp (Phillips et al., 1994).
Biến dị phân tử trong cây cấy mô đƣợc nhận diện ở mức độ DNA và protein.
Biến dị ở mức độ DNA đƣợc nghiên cứu nhiều nhất bằng cách sử dụng phương pháp phân tích enzyme giới hạn. Trong hầu hết trường hợp, những thay đổi về kiểu giới hạn xảy ra như kích thước đoạn bị thay đổi hơn là sự thêm vào hoặc mất đoạn giới hạn (Kaeppler et al., 1998).
Methyl hóa DNA
Sự methyl hóa DNA liên quan đến sự biểu hiện bị thay đổi của gen ở rất nhiều loài thực vật và động vật. Vai trò trực tiếp của methyl hóa DNA trong sự biểu hiện gen vẫn còn là chủ đề tranh cãi mặc dù sự methyl hóa cytosine có
liên quan đến sự biểu hiện gen bị sửa đổi ở thực vật và động vật. Sự methyl hóa có thể tăng cường các biến dị tính trạng số lượng vì một số gen có thể bị ảnh hưởng cùng lúc (Phillips et al., 1990). Tăng sự methyl hóa in vitro có tiềm năng làm tăng sự điều hòa và hoạt động của gen. Sự methyl hóa gen làm bất hoạt quá trình phiên mã và kết quả là kiểm soát sự biểu hiện của gen trong quá trình phát sinh phôi soma (Duncan, 1997). Theo Lambe et al. (1997), sự methyl hóa gen liên quan đến sự biệt hóa tế bào và sự loại bỏ khả năng biệt hóa của tế bào là nguyên nhân gây mất khả năng phát sinh cơ quan. Biến dị tạo ra do sự methyl hóa DNA có tính chất biểu sinh "epigenetic".
2.7.3 Phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma tính chống chịu mặn Nuôi cấy in vitro tế bào thực vật, mô hay cơ quan trên môi trường có chứa tác nhân chọn lọc tạo cơ hội để chọn lọc và tái sinh cây với các đặc tính mong muốn. Kỹ thuật này cũng đƣợc sử dụng có hiệu quả để cảm ứng sự chống chịu bao gồm việc sử dụng một vài tác nhân chọn lọc cho phép sự sống sót và sinh trưởng một cách ưu ái của những kiểu hình mong muốn (Purohit et al., 1998). Các tác nhân đƣợc sử dụng trong chọn lọc in vitro là NaCl (cho tính chống chịu mặn), PEG hoặc mannitol (cho tính chống chịu hạn), dịch lọc nuôi cấy nấm đặc hiệu (fungal culture filtrate-FCF) hoặc phytotoxin nhƣ fusaric acid hoặc mầm bệnh (cho tính kháng bệnh). Mẫu cấy đƣợc tiếp xúc với một giới hạn rộng các tác nhân chọn lọc được thêm vào môi trường nuôi cấy.
Chỉ những mẫu cấy có khả năng chịu đựng được môi trường này sống sót trong một thời gian dài đƣợc chọn lọc.
Hai kiểu phương pháp chọn lọc được đề nghị là chọn lọc dần dần (gradual selection), hay còn gọi là chọn lọc lâu dài (long-term selection) hay xử lý lâu dài theo dạng bậc thang (stepwise long-term), nghĩa là mẫu cấy đƣợc tiếp xúc với stress với nồng độ tác nhân chọn lọc tăng dần và thứ hai là chọn lọc tái diễn (recurrent selection), hay còn gọi là chọn lọc một bước (single step) hay xử lý sốc, trong đó mẫu cấy đƣợc tiếp xúc trực tiếp với sốc ở nồng độ cao và chỉ những mẫu chịu đựng đƣợc mức độ này mới sống sót (Purohit et al., 1998). Các phương pháp này dựa trên sự tạo các biến dị di truyền giữa các tế bào, mô và/hoặc cơ quan trong nuôi cấy và tái sinh cây (Mohamed et al., 2000). Chọn lọc in vitro có thể rút ngắn một cách đáng kể thời gian chọn lọc các tính trạng mong muốn dưới áp lực chọn lọc với các tương tác môi trường thấp nhất và có thể chọn lọc ngoài đồng để bổ sung (Jain, 2001). Theo Dix (1990) thì phương pháp chọn lọc lâu dài ở nồng độ muối cao dường như là chiến lược tốt nhất. Tuy nhiên, nồng độ muối cao hơn làm thấp sự sinh trưởng của mô sẹo và vì vậy làm hạn chế mật số tế bào mà các đột biến có thể xảy ra.
Chọn lọc lâu dài làm tăng các sai khác nhiễm sắc thể tích lũy trong các tế bào
được nuôi cấy và cuối cùng là làm giảm tỉ lệ tái sinh cây dưới mức độ có thể chấp nhận được. Ở cây thuốc lá, Nabor et al. (1980) đã sử dụng phương pháp chọn lọc tái diễn với các nồng độ muối NaCl tăng cho thấy dường như cây tái sinh có nhiều hơn một dạng chống chịu mặn.
Vật liệu dùng trong kỹ thuật chọn lọc in vitro bao gồm mô sẹo, nuôi cấy treo, phôi vô tính, nuôi cấy chồi... Trong đó, mô sẹo (callus) hoặc mô sẹo phát sinh phôi (embryogenic callus) là vật liệu thường được sử dụng trong nhiều nghiên cứu.
2.7.4 Một số ưu và khuyết điểm của phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma
2.7.4.1 Ƣu điểm
Theo Jain (2001), phương pháp chọn lọc biến dị soma có các ưu điểm nhƣ:
- Các biến đổi có thể xảy ra ở các tính trạng nông học quan trọng.
- Xảy ra với tần suất cao.
- Một vài thay đổi có thể mới và có thể không có được bằng phương pháp chọn giống truyền thống.
- Chọn lọc in vitro có thể giúp phân lập các dòng chống chịu với stress sinh học và phi sinh học.
- Rút ngắn thời gian phân lập dòng soma với tính trạng mong muốn.
- Một quần thể lớn tế bào đƣợc sử dụng cho chọn lọc.
2.7.4.2 Khuyết điểm
Mặc dù có nhiều thuận lợi, sự phát triển của cây chống chịu stress thông qua chọn lọc in vitro có một vài hạn chế nhƣ:
- Mất khả năng tái sinh trong suốt quá trình chọn lọc.
- Thiếu sự tương quan giữa các cơ chế chống chịu hoạt động trong tế bào, mô hay cơ quan và của cả cây với hiện tƣợng thích nghi biểu sinh. Trong suốt chọn lọc in vitro, các tế bào không chống chịu đôi khi có thể trải qua sự thích nghi biểu sinh nghĩa là các thay đổi biểu sinh bền vững (stable epigenetic alterations) được thừa hưởng chỉ thông qua sự phân bào (mitosis) mà không phải thông qua sự phân bào giảm nhiễm (meiosis) đối với tác nhân chọn lọc đặc hiệu, vì vậy che khuất sự chọn lọc các đột biến hiếm có khả năng chống chịu thật sự (meiotically inherited) (Tal, 1994). Hàng loạt các nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa DNA đƣợc sửa đổi là nguyên nhân chính gây ra các sửa
đổi biểu sinh thỉnh thoảng xuất hiện trong điều kiện nuôi cấy mô (Guo et al., 2007; Li et al., 2007; Gao et al., 2010). Nhiều tác giả đề nghị rằng vấn đề thích nghi biểu sinh trong chọn lọc in vitro có thể đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng chọn lọc ngắn hạn hoặc chọn lọc từng bước một có thể giúp ngăn chặn sự phát triển của các tế bào thích nghi biểu sinh (Chandler and Vasil, 1984;
Tal, 1994).
Bên cạnh hạn chế về vấn đề các dòng soma đƣợc chọn lọc in vitro có thể không bền vững về mặt di truyền, Jain (2001) còn cho rằng phương pháp này cũng có một số bất lợi nhỏ nhƣ:
- Có thể không xảy ra đối với các tính trạng nông học phức tạp.
- Nhiều đặc điểm thay đổi theo hướng ngược lại hoặc hướng tiêu cực.
- Các biến dị không thể dự đoán đƣợc trong tự nhiên.
2.7.5 Đặc điểm của cây chịu mặn trong chọn lọc in vitro
Các mô sẹo chống chịu mặn thường được đưa vào con đường sinh phôi nhằm tạo cây con có tính chống chịu qua đó đánh giá kết quả của việc chọn lọc. Một số đặc điểm của cây chịu mặn đƣợc chọn lọc in vitro đã đƣợc một số tác giả phân tích và áp dụng. Về mặt sinh lý, nhiều quá trình bị ảnh hưởng bởi mặn nhưng sinh trưởng tế bào bị giảm, diện tích lá, sinh khối và sản lượng là quan trọng nhất. Giảm sinh trưởng là hiện tượng phổ biến của cây bị stress mặn, đƣợc quan sát trong cơ quan, mô, hay tế bào đƣợc nuôi cấy trên môi trường bổ sung muối NaCl. Thật vậy, sinh trưởng chậm hơn là đặc điểm thích nghi để sống sót của cây dưới điều kiện stress và khả năng chịu mặn thường tương quan nghịch đến tốc độ tăng trưởng (Queiros et al., 2007). Tốc độ quang hợp luôn chậm hơn ở cây bị ngộ độc mặn (Parida and Das, 2005). Khả năng quang hợp của lá phụ thuộc vào đặc điểm sinh lý nhƣ hàm lƣợng diệp lục tố, hoạt động của Rubisco và hiệu quả của hệ thống quang. Sự giảm hàm lƣợng diệp lục tố của cây đi cùng với hiệu quả thấp hơn của PS II và sự lão hóa (Ehsanzadeh et al., 2009).
Theo Arzani (2008), tổn thương lá là một thông số nữa để thanh lọc khả năng chịu mặn và có thể đo bằng sự tổn hại màng, mất diệp lục tố sớm hoặc tổn hại bộ máy quang hợp. Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ có thể phân biệt giữa các kiểu gen chống chịu mặn thấp hoặc trung bình.
Một số cơ chế chống chịu mặn phổ biến tồn tại trong cây nhƣ hệ thống bảo vệ chống oxy hóa, ion homeostasis (nội cân bằng ion), sự thích nghi thẩm thấu, sự truyền tín hiệu và sự điều hòa biểu hiện gen (Lu et al., 2007). Hệ thống bảo vệ chống oxy hóa tương quan dương với sự chống chịu mặn của
cây, vì vậy trong một số nghiên cứu, cây con chống chịu mặn đƣợc chọn lọc in vitro đƣợc nhận diện bằng cách đo các enzyme oxy hóa chủ yếu là SOD, APX, CAT và GR (Piqueras et al., 1996; Hossain et al., 2007; Lu et al., 2007;
He et al., 2009).
Lipid đóng vai trò quan trọng trong thành phần cấu trúc của hầu hết màng tế bào (Parida and Das, 2005). Sự peroxide hóa màng lipid bởi gốc tự do là tín hiệu tổn hại do stress ở mức độ tế bào. Vì vậy mức độ malondialdehyde (MDA), được sản sinh trong lúc peroxide hóa các lipid màng, thường được sử dụng để chỉ thị cho sự tổn hại oxy hóa (Demiral and Turkan, 2005). Các dòng mô sẹo đƣợc chọn lọc chống chịu mặn muối NaCl của cây Solanum tuberosum cho thấy sự tăng peroxide hóa lipid (Queiros et al., 2007).
Hầu hết những nghiên cứu đƣợc thực hiện liên quan đến chọn lọc in vitro là dựa trên sự nội cân bằng ion và các chất tan tương hợp chủ yếu là proline (He et al., 2009). Khi mặn do NaCl vƣợt quá ngƣỡng, dạng muối phổ biến nhất của stress mặn, nồng độ Na+ trong cây tăng và nồng độ K+ giảm (Kumar et al., 2008). Để khắc phục stress mặn, cây tạo ra các cơ chế bảo vệ giúp nó thích nghi. Các cơ chế này bao gồm sự điều chỉnh thẩm thấu, đi cùng với sự tích lũy các chất tan tương hợp như proline, glycine betaine và polyols (Ghoulam et al., 2001).