2.9 Phương pháp gây đột biến cây trồng in vitro
2.9.4 Phương pháp tạo đột biến in vitro bằng xử lý tia gamma
Khác với bức xạ hạt alpha và beta, bức xạ gamma không phải là bức xạ hạt. Bức xạ gamma là bức xạ điện từ phát ra từ hạt nhân của nguyên tử. Bức xạ gamma có ký hiệu γ thường phát kèm khi các đồng vị phóng xạ phát bức xạ
alpha hay beta, nhƣng cũng có những đồng vị chỉ phát bức xạ gamma. Bức xạ gamma không có khối lƣợng, không có điện tích.
Tia gamma không bị lệch trong điện trường, có bước sóng rất ngắn
<0,05 Ao. Do đó có sức xuyên mạnh nhƣng do không mang điện nên khi đi qua cơ thể sinh vật không có tác dụng điện ly trực tiếp mà chỉ có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện (Luyện Hữu Chỉ et al., 1997).
2.9.4.2 Một số đặc trƣng của chất phóng xạ Tương tác của bức xạ ion hóa với vật chất
Tác hại của bức xạ lên cơ thể sinh vật sống phụ thuộc vào sự hấp thụ năng lƣợng bức xạ của mô sinh học. Do đó, đơn vị cơ bản của liều lƣợng bức xạ đƣợc biễu diễn qua năng lƣợng hấp thụ trên một đơn vị khối lƣợng của mô.
Liều hấp thụ (Absorbed dose – ký hiệu D): Là tỉ số giữa năng lƣợng trung bình dɛ mà bức xạ truyền cho vật chất trong thể tích nguyên tố và khối lƣợng vật chất dm của thể tích đó (D = dɛ dm). Đơn vị liều hấp thụ là Gray (Gy). 1 Gy bằng năng lƣợng 1 June truyền cho 1 kg vật chất (1 Gy = 1 J/kg).
Ngoài ra, liều hấp thụ còn đƣợc đo bằng rad. 1 rad là liều hấp thụ 100 erg (1 J
= 107 erg) trên 1 g, hay 1 rad = 100 erg/g hoặc 1 rad = 0,01 Gy.
Suất liều hấp thụ: Là liều hấp thụ trong một đơn vị thời gian. Đơn vị suất liều hấp thụ là Gy/s hay rad/s hoặc rad h (Dương Tấn Nhựt, 2009).
Các liều bức xạ đƣợc phân thành ba cấp bậc phân biệt là liều cao (>10 kGy), liều trung bình (1 đến 10 kGy) và liều thấp (<1 kGy). Các liều cao đƣợc sử dụng để khử trùng thực phẩm, và liều thấp để cảm ứng các đột biến ở vật liệu hạt giống, trong đó dãy liều từ 60 đến 700 Gy áp dụng đối với cây trồng nhân giống bằng hạt như lúa gạo, bắp, đậu và hạt cải dầu. Trong trường hợp vật liệu cây trồng đƣợc nuôi cấy in vitro, do chỉ một vài milligram mô cấy và một vài microgram tế bào huyền phù đƣợc chiếu xạ, nên các mức liều càng thấp hơn nữa (IAEA, 1997 trích dẫn của Dương Tấn Nhựt, 2009).
2.9.4.3 Phương pháp thực hiện
Phương pháp cảm ứng đột biến và chọn lọc in vitro đã được nghiên cứu ở rất nhiều loài cây trồng. Mô sẹo đƣợc xử lý với tác nhân gây đột biến và chồi được tái sinh trên môi trường cảm ứng tạo chồi. Áp lực chọn lọc có thể đƣợc áp dụng ở giai đoạn này. Chồi đƣợc tái sinh sau đó đƣợc cấy chuyền để loại bỏ thể khảm trên môi trường chọn lọc và những chồi sống sót được tạo rễ và tiếp theo đó sẽ được test trong nhà lưới trước khi đánh giá ở ngoài đồng (Pathirana, 2011).
Cụ thể trong phương pháp gây đột biến bằng chiếu xạ tia gamma, vật liệu sẽ đƣợc nuôi cấy trong đĩa petri để đem xử lý. Sau đó mẫu cấy sẽ đƣợc theo dõi khả năng sống và sinh trưởng. Liều gây chết 50% (LD50) thường được ghi nhận. Có thể kết hợp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có chứa các tác nhân chọn lọc như là NaCl (cho tính chống chịu mặn), PEG hoặc mannitol (cho tính chống chịu hạn), dịch lọc nuôi cấy nấm đặc hiệu (fungal culture filtrate-FCF) hoặc phytotoxin nhƣ fusaric acid hoặc mầm bệnh (cho tính kháng bệnh) để tạo các dòng/giống mới có khả năng chống chịu (Purohit et al., 1998).
Vật liệu xử lý
Qua các tài liệu được công bố cho thấy vật liệu thường được sử dụng là mô sẹo, mô sẹo phát sinh phôi (embryonic callus) hay đỉnh chồi.
Liều chiếu xạ
Liều chiếu xạ thường từ 5-80 Gy tùy theo vật liệu nghiên cứu. Theo IAEA (1997, trích dẫn của Dương Tấn Nhựt, 2009), vật liệu mô sẹo sẽ cho tính nhạy cảm hơn đối với xử lý bức xạ, và đòi hỏi các liều thấp hơn (2-5 Gy), hơn là các đoạn cắt thân hoặc chiếu xạ các hạt giống; với các liều tương đối cao hơn (15-20 Gy) các mẫu sẽ bị chết hoặc mất đi khả năng tái sinh. Theo Hoàng Trọng Phán và Trương Thị Bích Phượng (2008), để thu được nhiều đột biến có giá trị chọn giống cao mà không gây phương hại đến sức sống, độ hữu thụ hoặc gây chết cây, người ta đã tìm ra liều lượng tới hạn cho nhiều loài cây khác nhau. Theo đó, ở M1 chỉ còn 30-40% cây sống sót và ra hoa kết quả (LD30-40). Trong nghiên cứu chọn giống phóng xạ, người ta thường dùng liều LD50. Ngoài ra, người ta cũng tìm ra liều lượng thích hợp (thường thấp hơn liều tới hạn 1,5-2 lần) cho công tác chọn giống đối với một số cây trồng.
Cũng theo Trần Thƣợng Tuấn (1992), tốt nhất là chỉ dùng những liều làm giảm tỉ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trưởng.
Phát hiện đột biến
Các dòng đột biến thu được trước tiên thường được nhận diện bằng cách quan sát các đặc điểm hình thái. Bên cạnh đó, còn có một số chỉ tiêu khác có thể dùng để nhận diện các dạng đột biến về khả năng chống chịu các tác nhân chọn lọc trong môi trường nuôi cấy. Ví dụ như trong chọn lọc dòng chống chịu mặn, rất nhiều tác giả dùng chỉ tiêu hàm lƣợng proline, glycine betaine, polyols nhƣ là chỉ thị để nhận diện bởi vì các chất này đƣợc tích lũy để điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào khi nồng độ muối bên ngoài môi trường cao (Ghoulam et al., 2001); hoặc mức độ malondialdehyde (MDA), đƣợc sản sinh trong lúc peroxide hóa các lipid màng, thường được sử dụng để chỉ thị cho sự tổn hại oxy hóa (Demiral and Turkan, 2005); hệ thống bảo vệ chống
oxy hóa tương quan dương với sự chống chịu mặn của cây, vì vậy trong một số nghiên cứu, cây con chống chịu mặn đƣợc chọn lọc in vitro đƣợc nhận diện bằng cách đo các enzyme oxy hóa chủ yếu là SOD, APX, CAT và GR (Piqueras et al., 1996; He et al., 2009)...
Chính xác hơn, để đánh giá sự sai khác về mặt di truyền, người ta thường sử dụng các marker phân tử để phân tích. Bên cạnh đó, có thể phát hiện đột biến bằng cách đọc trình tự sản phẩm PCR (DNA sequencing) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).