CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.3 Nội dung 3: Đánh giá khả năng chọn tạo các dòng đậu nành chống chịu mặn bằng phương pháp tạo biến dị soma và chiếu xạ tia gamma
3.2.3.1 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo đậu nành MTĐ 760-4
a) Thí nghiệm 6a: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 1
Vật liệu: Mô sẹo 4 tuần tuổi được cảm ứng từ tử diệp trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 5 mg/L.
Cách tiến hành: Hạt đậu nành đƣợc khử trùng và tách tử diệp nhƣ phương pháp được mô tả ở thí nghiệm 3. Mẫu tử diệp được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 5 mg L (môi trường được chọn trong thí nghiệm 3).
Sau 4 tuần, mô sẹo đƣợc hình thành có dạng xốp, rời rạc sẽ đƣợc tách thành cụm có kích thước khoảng 0,5x0,5 cm và cấy vào môi trường MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 5 nghiệm thức là các nồng độ muối NaCl 0; 2,5; 5; 7,5 và 10 g/L. Mỗi nghiệm thức lặp lại 10 lần, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 5 mẫu mô sẹo.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỉ lệ sống (%) của mô sẹo: (Tổng số mô sẹo còn sống tổng số mẫu cấy) x 100. Mô sẹo còn sống là mô sẹo có sự sinh trưởng bình thường (tăng kích thước) và có màu vàng sáng, trong khi mô sẹo bị chết có màu nâu đen và không gia tăng kích thước hoặc tăng rất ít (Hình 3.2).
Mô sẹo sống Mô sẹo sống
Mô sẹo chết Mô sẹo chết
Hình 3.2: Sinh trưởng mô sẹo trên môi trường chọn lọc với muối NaCl - Hàm lượng proline trong mô sẹo (mol g trọng lượng tươi) được phân tích trong lần chọn lọc thứ 4 với 4 lần lặp lại trong một nghiệm thức. Quy trình phân tích proline được thực hiện theo Bates et al. (1973) gồm các bước:
+ Chuẩn bị dung dịch ninhydrine: Lấy 1,25 g ninhydrine + 30 mL acid acetic + 20 mL acid phosphoric 6M khuấy đều cho ninhydrine tan hoàn toàn và trữ ở nhiệt độ khoảng 4C.
+ Cân 0,5 g mô sẹo đậu nành, dùng chày cối nghiền nhuyễn, bột mô sẹo đƣợc cho vào ống nghiệm 13x100 mm, thêm 10 ml acid sulfosalicylic 3% lắc đều. Cho các ống nghiệm này vào trong máy ly tâm trong 20 phút với vận tốc 3.000 vòng phút. Sau đó, hút lấy 2 mL dung dịch nổi lên bên trên cho vào ống nghiệm và cho thêm 2 mL dung dịch ninhydrine và 2 mL acid acetic lắc đều rồi đun sôi (100C) trong 1 giờ, lấy ra ngâm vào nước đá khoảng vài phút.
Cho thêm vào ống tube 4 mL dung dịch toluene rồi lắc đều trên vortexer khoảng 15-20 giây, sau vài phút dung dịch hỗn hợp toluene và proline sẽ nổi lên trên, hút dung dịch này vào cuvette thủy tinh và dùng máy quang phổ kế để đo ở bước sóng 520 nm.
Lưu ý: Cần dùng toluene nguyên chất để chuẩn máy trước khi đo mẫu phân tích.
+ Nồng độ proline được xác định dựa vào đường chuẩn proline với dãy nồng độ từ 0 g mL đến 14 g mL và công thức proline trên trọng lượng tươi của mô sẹo nhƣ sau:
Y×4×5 P =
115,5×m Trong đó:
P: Hàm lượng proline (mol g trọng lượng tươi)
Y: Nồng độ proline g mL (xác định đường cong chuẩn proline) 4: Là 4 ml toluene đƣợc sử dụng
m: Là trọng lượng tươi của mô sẹo 115,5: Là phân tử gam của proline
5=10 2: Là 2 mL dung dịch ly trích từ 10 mL dung dịch hỗn hợp acid sulfosalicylic 3% và mẫu mô sẹo.
Thời gian lấy chỉ tiêu là 1 tuần lần trong thời gian 5 tuần.
b) Thí nghiệm 6b: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 2
Vật liệu: Mô sẹo còn sống sau 5 tuần trên môi trường mặn của thí nghiệm 6a.
Cách tiến hành: Mẫu mô sẹo được tách thành cụm có kích thước 0,5x0,5 cm và cấy vào môi trường MS có bổ sung các nồng độ muối NaCl tương tự môi trường ban đầu.
Bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi tương tự thí nghiệm 6a.
c) Thí nghiệm 6c: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 3
Vật liệu: Mô sẹo còn sống sau 5 tuần trên môi trường mặn của thí nghiệm 6b.
Cách tiến hành: Tương tự thí nghiệm 6b.
Bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi tương tự thí nghiệm 6a.
d) Thí nghiệm 6d: Ảnh hưởng của muối NaCl lên sự sinh trưởng của mô sẹo trong lần chọn lọc 4
Vật liệu: Mô sẹo còn sống sau 5 tuần trên môi trường mặn của thí nghiệm 6c.
Cách tiến hành: Tương tự thí nghiệm 6b.
Bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi tương tự thí nghiệm 6a.