1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM DIỆT TUYẾN TRÙNG
1.2.2. Phân loại nấm diệt tuyến trùng
1.2.2.3. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng
Nấm ký sinh trứng tuyến trùng sử dụng động bào tử, giác bám, hoặc bào tử được đưa vào bằng đường miệng tuyến trùng. Bào tử nảy mầm xâm nhập nhanh chóng vào tuyến trùng bằng cách hình thành cấu trúc sợi nấm [117]. Khi nấm xâm nhập vào tuyến trùng, quá trình sinh trưởng của nấm sẽ xảy ra trong tuyến trùng. Nấm nội ký sinh như Ophiocordy cipitaceae nảy mầm trong đường tiêu hóa của tuyến trùng Harposporium sp. sinh trưởng và tiêu diệt chúng [55].
Các loại nấm ký sinh trứng tuyến trùng thường bắt gặp trong các giai đoạn không di động của tuyến trùng. Một số nấm ký sinh trứng chỉ sử dụng giác bám, một loại giác bám chuyên biệt thâm nhập hoặc sử dụng các nhánh sợi nấm để lây nhiễm vỏ trứng tuyến trùng [117]. Các loài đại diện của nấm ký sinh trứng tuyến trùng bao gồm Pochonia chlamydosporia, Paecilomyces lilacinus (Purpureocillium lilacinum), Clonostachys rosea và Lecanicillium psalliotae. P. lilacinus thường phân bố ở các khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, trong khi đó, Lecanicillium chủ yếu được tìm thấy ở các khu vực nhiệt đới [177]. Những chi này đều thuộc nhóm nấm Ascomycota và có mối quan hệ chặt chẽ với nhiều loại nấm diệt côn trùng như Metarhizium.
Vỏ trứng của tuyến trùng bao gồm ba lớp riêng biệt và chủ yếu bao gồm protein, chitin và lớp vô định hình [195]. Sự xâm nhập vào vỏ trứng của tuyến trùng xảy ra từ một điểm chuyên biệt hoặc các nhánh bên của sợi nấm. Chitinase và protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình làm mỏng vỏ trứng và dẫn đến sự tan rã của các lớp vỏ trứng [117, 195]. Paecilomyces lilacinus sinh tổng hợp một số chitinase và protease có liên quan đến tốc độ phá hỏng mạnh mẽ của cấu trúc vỏ trứng [93].
Theo Ocralit và cs., (2009), một trong những công bố đầu tiên về khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita và Globodera pallida của nấm sợi P. lilacinus là của Jatala và cs., (1979) [140]. Kể từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu công bố trên thế giới về khả năng diệt tuyến trùng sần rễ Meloidogyne của chi nấm này ở cả trong khu thí nghiệm nhà kính và thực tế ngoài đồng ruộng được tiến hành. Một trong những ưu điểm để chi nấm ký sinh trứng tuyến trùng được quan tâm nghiên cứu nhiều
16
và đưa vào sản xuất chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng là do hiệu quả cao, tính an toàn của chúng đối với con người và môi trường [32, 84, 91, 154].
Giới thiệu về Paecilomyces sp.
Paecilomyces thuộc ngành nấm túi Ascomycota, Lớp Euascomycetes; Bộ Eurotiales; Họ Trichocomaceae. Chi Paecilomyces gồm nhiều loài như: P. lilacinus (Purpureocillium lilacinum), P. variotii, P. lavendulum….
Paecilomyces diệt tuyến trùng với cơ chế ký sinh trực tiếp lên trứng và ấu trùng đồng thời sinh tổng hợp enzym như chitinase, protease có khả năng phân hủy lớp chitin bên ngoài của ấu trùng và ức chế nở trứng [9, 95, 107, 117, 175]. Thành phần vỏ trứng tuyến trùng có 40% (w/w) là chitin. Nấm ký sinh trứng tuyến trùng có thể sinh tổng hợp chitinase ngoại bào để xâm nhập vào vỏ trứng tuyến trùng trong quá trình tiêu diệt. Ngoài chitinase, protease cũng góp phần phá vỡ lớp biểu bì tuyến trùng và vỏ trứng. Các nghiên cứu của Khan và cs., (2004), (2001), Gortari và cs., (2008) đã xác định cấu trúc, chức năng và quá trình sinh tổng hợp các enzym, từ đó đã công bố vai trò của enzym liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng [65, 93, 96]. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy sợi nấm P. lilacinus xâm nhập trực tiếp vào lớp biểu bì của trứng, ấu trùng của Meloidogyne javanica [9, 95]. Kiewnick và Sikora (2006) đã thử nghiệm khả năng kiểm soát tuyến trùng sần rễ Meloidogyne incognita ký sinh trên cà chua của P. lilacinus 251, kết quả là làm giảm lượng mật độ ấu trùng trong rễ đến 71% so với mẫu đối chứng [98]. Paecilomyces lilacinus (Purpureocillium lilacinum) được coi là yếu tố phòng trừ bệnh thực vật gây ra bởi tuyến trùng [130].
Sau đây là một số công trình nghiên cứu về chitinase và protease ngoại bào từ các chủng vi nấm diệt tuyến trùng nhằm làm sáng tỏ hơn vai trò của chitinase và protease tham gia vào cơ chế diệt tuyến trùng.
Chitinase từ nấm diệt tuyến trùng
Các chitinase của nấm sợi chủ yếu thuộc nhóm GH18, ngoại lệ là NbChiA từ Nosema bombycis trong họ GH19 [70]. Tuy nhiên, các phân nhóm chitinase GH18 của nấm sợi không tương ứng với các nhóm cùng tên trong số các enzym GH18 của
17
vi khuẩn. Giống như vi khuẩn, chitinase của nấm sợi cũng có thể có cấu trúc nhiều trung tâm hoạt động [78]. Theo Seidl-Seiboth và cs., (2014), ở Trichoderma harzianum và Trichoderma viride, chitinase bao gồm nhiều loại chitinase thuộc GH18 ngoại bào được sử dụng để sản xuất các loại chitinase có bán trên thị trường [20].
Vào những năm 1980, lần đầu tiên các nghiên cứu nhằm sàng lọc các chủng nấm diệt tuyến trùng trong đất đã chứng minh mối liên quan giữa hoạt tính chitinase của nấm diệt tuyến trùng với khả năng diệt tuyến trùng [43]. Theo Yang và cs., (2007), các chi nấm diệt tuyến trùng như Pochonia, Arthrobotrys, Paecilomyces được coi như các tác nhân sinh học diệt tuyến trùng [195]. Dackman và cs., (1989) đã công bố hai loài thuộc chi Verticillium có khả năng diệt Heterodera schachtii nhờ hoạt tính chitinase và protease của chi nấm này [43].
Những năm đầu thế kỷ 21, Tikhonov và cs., (2002) đã tinh sạch chitinase Chi43 từ hai loài riêng biệt thuộc chi Verticillium. Khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét, trên các bề mặt của trứng Globodera pallida xuất hiện các vết sẹo do enzym phân hủy. Các vết này thể hiện rõ nét hơn khi xử lý bằng Chi43 kết hợp với P32 là một protease được nấm tiết ra trong quá trình xâm nhập vào trứng [167]. Sau đó Mi và cs., (2010) đã công bố gen mã hóa chitinase GH18, PcChi44, từ Pochonia chlamydosporia đồng thời cũng biểu hiện thành công chitinase này ở E. coli. Enzym tái tổ hợp PcChi44 được tiến hành ủ với trứng của tuyến trùng Meloidogyne javanica và nhận thấy enzym này làm suy giảm đáng kể đến bề mặt của vỏ trứng. Ngoài ra, các nhà khoa học còn chứng minh PcChi44 cũng có tác động đối với trứng B. mori [125].
Theo nghiên cứu của Li và cs., (2006) cho thấy hầu hết các loại nấm thường sinh tổng hợp nhiều hơn một loại chitinase và các enzym này tương tác với nhau [54].
Các công bố hiện nay cho thấy, nhiều loài nấm ký sinh (ví dụ Trichoderma harzianum) được coi là nguồn sản xuất các chitinase công nghiệp [21, 54, 62].
Không giống như vi khuẩn, ở nấm sợi, chitin là thành phần chính của thành tế bào. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia, sinh trưởng và hình thành tế bào nấm. Các loại nấm sợi như Trichoderma, Penicillium, Neurospora,
18
Mucor, Aspergillus, Conidiobolus và Beauveria tiết ra các loại chitinase khác nhau [73].
Nghiên cứu của Park và cs., (2004) đã sàng lọc các chủng nấm chống tuyến trùng dựa vào khả năng phân hủy protein, chitin và thử nghiệm khả năng diệt ấu trùng của loài Meloidogyne javanica. Kết quả nghiên cứu cho thấy P. lilacinus gây chết đối với Caenorhabditis trưởng thành [144]. Ngoài ra, Khan và cs., (2003) đã sử dụng điện di trên gel 2D dịch nuôi cấy P. lilacinum 251 và tìm ra 6 protein có hoạt tính chitinase [92]. Tác dụng của chế phẩm dạng bán tinh khiết có chứa các chitinase này được thử nghiệm trên trứng của tuyến trùng M. javanica dưới dạng đơn lẻ hoặc kết hợp với một protease ngoại bào cho hiệu quả ức chế 79% sự nở của ấu trùng làm cho tuyến trùng bất động, biến dạng và cấu trúc vỏ trứng bị thay đổi mạnh. Kết quả soi trên kính hiển vi điện tử cho thấy: trứng được xử lý protease, lớp lipid bên trong biến mất, do đó làm tăng tính thấm của trứng, tác dụng của chitinase là phân hủy đặc thù cho lớp chitin trung gian. Tuy nhiên, khi sử dụng kết hợp protease và chitinase hiệu quả tác động mạnh hơn làm co lipid và lớp chitin bị thủy phân [93]. Chan và cs., (2010) đã nghiên cứu gen PjChi-1 tổng hợp chitinase được phân lập từ Paecilomyces javanicus (còn gọi là Isaria javanica) và thử nghiệm hiệu quả diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita bằng cách chuyển gen đó lên cây cà chua. Nghiên cứu đã chứng minh hoạt động endochitinase ở cây cà chua mang gen PjChi-1 cao so với đối chứng. Điều này được xác định bằng sự giảm hàm lượng chitin của vỏ trứng tuyến trùng, do đó kéo theo những ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của ấu trùng [35].
Gần đây, chitinase từ loài nấm sợi Monacrosporium thaumasium và Duddingtonia flagrans đã được tách chiết, xác định hoạt tính, thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng. Kết quả cho thấy cả hai loài đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng khi sử dụng enzyme này [27, 156]. Theo nghiên cứu của Braga và cs., (2015), chitinase được chứng minh là ngoài tác dụng làm mỏng vỏ trứng tuyến trùng còn có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn [27]. Ở Trichoderma, các chitinase có liên quan đến sự phân hủy các sợi fibrin ngoại bào và thành tế bào. Gruber và cs., (2012) cho rằng sự
19
phân biệt giữa các chitinase là do khả năng phản ứng của chitinase với các cơ chất khác nhau [66].
Một loại endochitinase từ Trichoderma harzianum đã được biểu hiện trong cây thuốc lá nhằm kiểm tra khả năng đối kháng với tuyến trùng Meloidogyne hapla.
Theo nghiên cứu của Brants & Earle, (2002), hoạt tính chitinase tăng cao khi nuôi cấy tế bào cây thuốc lá chuyển gen tổng hợp endochitinase [29]. Theo Brants và cs., (2000) công bố các tín hiệu peptide có chức năng trong cây thuốc lá và do đó chitinase được biểu hiện sẽ được tiết ở vùng rễ nơi tiếp xúc với trứng của tuyến trùng M. hapla [28].
Theo nghiên cứu của Zhang và cs., (2014) cho thấy Trichoderma longibranchiatus đã ký sinh vào tuyến trùng Heterodera avenae và ức chế sự nở của nang trứng, với hiệu quả tỷ lệ thuận với hoạt tính của chitinase [199]. Những kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về Trichoderma harzianum, trong đó quá trình lây nhiễm của tuyến trùng có sự tham gia của một hệ thống phức tạp bao gồm sáu loại chitinase. Trichoderma harzianum đã nhận ra tín hiệu trên bề mặt tuyến trùng (thông qua yếu tố nhận biết) từ đó chúng đã kích hoạt cả sự hình thành cấu trúc nhiễm vào tuyến trùng và kích thích sự sản sinh chitinase trong nấm, hai quá trình cơ bản để xâm nhập vào thành tế bào tuyến trùng. Từ đó các nhà khoa học đã nhận định rằng lớp vỏ trứng tuyến trùng được cấu tạo bởi lớp chitin và hàng loạt các nghiên cứu về lớp biểu bì của tuyến trùng. Các công bố trong những năm tiếp theo về chitinase từ nấm sợi phá hủy lớp biểu bì tuyến trùng như của Braga và cs., (2015), Chen và cs., (2015), Park và cs., (2002) [27, 38, 143].
Gan và cs., (2007) công bố đã biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase lpchi1 từ nấm Lecanicillium psalliotae (hay còn gọi là Verticillium psalliotae) vào nấm men [63]. Tác dụng của enzym tái tổ hợp này đã được thử nghiệm trên trứng tuyến trùng M. javanica ở dạng đơn lẻ hoặc kết hợp với protease Ver122. Chitinase được tinh sạch đã ức chế trứng nở (khoảng 38,2% ở dạng trứng so mẫu đối chứng, khoảng 19,8% không phát triển từ trứng thành ấu trùng) và khi kết hợp với protease, hiệu quả của nó được tăng cường thêm, cụ thể tỷ lệ nở giảm 56,5%.
20
Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới cho thấy chitinase từ nấm sợi đóng vai trò quan trọng trong quá trình diệt trứng cũng như ấu trùng và tuyến trùng. Từ đó, các chủng nấm sợi phân lập được trong đề tài được hướng tới nghiên cứu khả năng sinh chitinase tham gia vào vai trò diệt tuyến trùng.
Protease từ nấm diệt tuyến trùng
Cho đến nay, hơn 20 protease serine đã được tinh sạch hoặc xác định trọng lượng phân tử từ các loại nấm diệt tuyến trùng khác nhau [171, 192, 194]. Các nghiên cứu cơ chế tiêu diệt tuyến trùng đã chỉ ra rằng các protease này có thể làm suy giảm hiệu quả các lớp biểu bì tuyến trùng. Do đó, chúng còn được gọi là protease phân hủy tuyến trùng. Các cấu trúc tinh thể khác nhau của hai protease phân hủy lớp biểu bì, Ver112 (tìm thấy từ Lecanicillium psalliotae) và PL646 (tìm thấy từ Paecilomyces lilacinus) dẫn tới chức năng của chúng khác nhau [111]. Protease từ các chủng nấm này là các protease ngoại bào được sinh ra chủ yếu từ Verticillium lecanii và Metarhizium anisopliae [158]. Protease P32 đầu tiên được xác định từ Pochonia rubescens [116]. Sau đó, các protease tương tự cũng được tìm thấy trong các loại nấm diệt tuyến trùng khác. Năm 1994, hai protease tham gia vào cơ chế diệt tuyến trùng (PII và VCP1) đã được xác định lần lượt từ loài nấm Arthrobotrys oligospora và Pochonia chlamydosporia (hay có thể gọi là Verticillium chlamydosporium) [151, 171]. Gần đây, các protease diệt tuyến trùng từ nấm Paecilomyces lilacinus, Arthrobotrys oligospora được tìm thấy nhiều hơn bao gồm pSP3, Aoz1, Ver112, Mlx, PrC và Ds1 có khả năng diệt tuyến trùng [25, 129]. Ngày nay, các nhà khoa học cho rằng các protease khác nhau thì tác dụng diệt tuyến trùng khác nhau, đồng thời cũng diệt các vật chủ khác nhau. Do vậy, đối với những tuyến trùng khác nhau cần đối tượng nấm diệt tuyến trùng đặc thù [195].