3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp
3.1.1. Phân lập, sàng lọc các chủng nấm sợi
Từ 15 mẫu đất và rễ quanh cây hồ tiêu được thu thập tại tỉnh Đăk Lăk, 23 chủng nấm sợi đã được phân lập. Các chủng nấm sợi được định danh sơ bộ bằng hình thái, cấu trúc sinh bào tử. Hình 3.1 cho thấy trong số 23 chủng có 3 chủng nấm sợi không thuộc các chi Penicillium, Aspergillus và Fusarium đó là NV01, NV20 và P1.
Hình 3.1. Hình thái, cấu trúc sinh bào tử của các chủng nấm sợi KH Đặc điểm, Phân loại Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
NV01
Trên môi trường CDA, sau 5 ngày nuôi cấy, bào tử hình thành đến ngày thứ 14 khuẩn lạc màu vàng nhạt.
NV02
Khuẩn lạc màu đen, bào tử mịn.
(Aspergillus sp.)
62 NV03 Khuẩn lạc màu xanh
viền trắng bên ngoài, bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
NV04
Khuẩn lạc xanh nhạt sau 7 ngày chuyển màu xanh sẫm, bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
NV05 Khuẩn lạc trắng, sau 7 ngày chuyển màu ghi nhạt, bào tử đính.
(Aspergillus sp.)
NV20
Sợi nấm màu trắng phát triển lan trên bề mặt thạch. Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA. Dưới kính hiển vi điện tử từ ngày thứ 5, sợi nấm xuất hiện những nút vòng thắt.
63 P1
Trên môi trường CDA, sau 5 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc hình tròn đồng tâm dạng thảm nhung, sợi nấm màu trắng, sau chuyển sang tím nhạt và tím. Cuống bào tử dài, phân nhánh và mọc lên từ sợi nấm. Trên phần cuống có thể bình phồng ở phần gốc, nhọn ở đầu và mọc vươn thẳng, tạo thành cụm. Trên thể bình là những bào tử ovan dài tạo thành dạng chuỗi hoặc bị đứt đoạn.
P6 Khuẩn lạc sau 7 ngày có màu xanh cỏ úa, bào tử đính.
(Aspergillus sp.)
P7 Khuẩn lạc xanh, bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
EN8
Khuẩn lạc trắng, sau 7 ngày ngả vàng nhạt và xuất hiện giọt tiết, bào tử đính.
(Aspergillus sp.)
64 EN9 Khuẩn lạc xanh, bào
tử mịn
(Penicillium sp.)
EB10
Khuẩn lạc ở giữa có màu xanh sẫm, viền trắng ở xung quanh,, có giọt tiết. Bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
EB11 Khuẩn lạc màu trắng sợi dài.
(Fusarium sp.)
EB12
Khuẩn lạc có màu kem, sau 7 ngày chuyển màu ghi, bào tử đính.
(Aspergillus sp.)
65 EB13
Khuẩn lạc sau 7 ngày ngả vàng, bào tử mịn ở giữa.
(Aspergillus sp.)
DL14 Khuẩn lạc xanh, viền trắng, bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
DL15
Khuẩn lạc màu trắng, sau 7 ngày chuyển màu ghi nhạt, bào tử mịn.
(Aspergillus sp.)
T16
Khuẩn lạc xanh sau 7 ngày tiết sắc tố đỏ vào môi trường, bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
66 T17 Khuẩn lạc màu trắng,
sợi dài.
(Fusarium sp.)
K18 Khuẩn lạc màu trắng, sau 7 ngày ngả màu vàng nhạt, bào tử mịn.
(Penicillium sp.)
K19 Khuẩn lạc màu trắng ngả vàng, bào tử đính (Aspergillus sp.)
R21
Khuẩn lạc trắng bông, lan hết bề mặt, sợi bông dài, sau 7 ngày ngả màu vàng.
(Fusarium sp.)
67 R22
Khuẩn lạc xanh, bào tử mịn
(Penicillium sp.)
Ghi chú: Hình thái cấu trúc sinh bào tử dưới kính hiển vi ở vật kính 40x Nhằm hướng tới mục tiêu lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng diệt tuyến trùng, các chủng nấm được nuôi cấy lắc trên môi trường CD dịch thể trong thời gian 96 giờ nhiệt độ nuôi cấy 30 oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, dịch nuôi cấy được lọc và sử dụng để thử nghiệm với tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp. theo phương pháp 2.2.13.5. Các chủng có khả năng diệt tuyến trùng sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khảo sát khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.
Stt Ký hiệu chủng
Tỉ lệ tuyến trùng chết (%)
24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ
0 Đối chứng 1 (nước cất)
- - - - -
1 Đối chứng 2 (CD dịch thể)
- - - ± ±
2 P1 - 10,81± 0,75 30,7 ± 2,71 58,5 ± 2,39 58,5 ± 2,41 3 NV01 - 2,31 ± 0,24 15,6 ± 1,82 50,4 ± 2,84 50.4 ± 2,97 4 NV20 - 20,80 ± 2,51 40,17 ± 3,28 55,23 ± 4,12 55,23 ± 3,96
Ghi chú: (±): chết ˂ 3,0 %
Bảng 3.1 cho thấy, trong thời gian thử nghiệm đến 96 giờ, tuyến trùng cho tỷ lệ chết cao nhất đến 58% đối với P1; 55,23% đối với NV20; 50,4% đối với NV01.
Trong khoảng thời gian 72 - 96 giờ lượng trứng nở và ấu trùng sống sót bắt đầu giảm nhiều, có thể là tại thời điểm này các enzym phân hủy cùng với các độc tố bắt đầu
68
được sản sinh nhiều hơn nên đã có tác động đến khả năng tồn tại và phát triển quần thể của tuyến trùng so với mẫu đối chứng. Sau 96 giờ trở đi, lượng trứng và ấu trùng sống sót thay đổi không đáng kể, có thể do lượng enzym ủ lâu đã mất đi một phần hoạt tính [80, 81].
Perveen và S. Shahzad (2013) đã sử dụng dịch thể nuôi cấy Paecilomyces lilacinus, Paecilomyces variotii, Paecilomyces fumosoroseus, ủ với ấu trùng của tuyến trùng Meloidogyne incognita, kết quả cho thấy từ 72 giờ - 96 giờ khả năng diệt tuyến trùng đạt hiệu quả 75% [145]. Một nghiên cứu tương tự, Ajrami và cs., (2016) khi thử nghiệm Paecilomyces lilacinus với tuyến trùng Meloidogne javanica gây bệnh bướu rễ cây cà chua trong thời gian 72 - 96 giờ thì hiêụ quả diệt đạt 57%. Đồng thời nhóm nghiên cứu chế tạo viên nang chứa alginate kết hợp với P. lilacinus được sử dụng để thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng M. incognita trên cây cà chua trong nhà kính. Các viên P. lilacinus cho tỷ lệ giảm mật độ tuyến trùng ở vùng rễ là 66,7%, tương tự như vậy, viên P. chlamydosporia cho tỷ lệ giảm đến 90%, các nhà khoa học kết luận cả hai chủng đều có khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. [16].
Một nghiên cứu mới của Admad và cs., (2019), sử dụng Paecilomyces variotii cho kết quả thử nghiệm vượt trội, với hiệu quả lên đến 91,5% trong kiểm soát tuyến trùng bướu rễ, trong khi đó hiệu quả này là 96,4%, 99,7% và 98,9% khi sử dụng DMAC, diazinon và chiết xuất thực vật. Nghiên cứu được tiến hành trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne sp. với loài chủng phân lập (Paecilomyces variotii, P.
lilacinus, Duddingtonia flagrans, Trichoderma harzianum, Trichoderma asperelum) nhưng chỉ D. flagrans hoàn toàn không gây hại cho trứng còn bốn loài còn lại thì P.
lilacinus có khả năng giảm khả năng sống sót tới 67,9%, trong khi đó hiệu lực của P.
variotii chỉ là 25,1% [9].
Từ những kết quả thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng của P1, NV01 và NV20 cho thấy các chủng trên có thể sử dụng tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogynes sp.. Nhằm làm rõ hơn về cơ chế tiêu diệt, ba chủng nấm sợi trên được định danh bằng giải trình tự dựa trên đoạn ITS1/ITS4.
69