3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy và các loại môi trường quá trình sinh trưởng của chủng P1
Nhiệt độ nuôi cấy là yếu tố cần thiết, ảnh hưởng trực tiếp quá trình sinh trưởng của chủng P. lilacinus P1. Các kết quả được thể hiện trong hình 3.17A cho thấy: sau 144 giờ nuôi cấy, sinh khối sợi nấm thu được cao nhất ở nhiệt độ 30 oC, sau đó là ở 25 oC. Kết quả này tương tự như công bố cho thấy ở Phellinus sp. [40], Paecilomyces japonica nhưng lại khác so với Cordyceps militaris [124] sinh khối nhiều nhất ở 25oC.
Trên cơ sở môi trường đã lựa chọn để nuôi cấy P1 như CMA, Czapeck-Dox, PDA, CHY dịch thể với pH ban đầu là 7,0, tiến hành nuôi cấy trong thời gian 7 ngày, nhiệt độ nuôi cấy 30 oC; tốc độ lắc 200 vòng/phút. Lượng bào tử P1 đưa vào nuôi cấy là 100 àL với nồng độ bào tử 106/ml bào tử. Sau mỗi 24 giờ nuụi cấy, xỏc định sinh khối tươi chủng P1 tạo thành. Kết quả được trình bày ở Hình 3.17B cho thấy, trên môi trường CD và PDA dịch thể cho sinh khối ướt tương đương nhau (15,517 ± 0,439 mg/ml và 15,103 ± 0,245 mg/ml).
Hình 3.17. Các yếu tổ ảnh hưởng thu hồi sinh khối của P. lilacinus P1; (A). Ảnh hưởng thời gian, (B). Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy.
Từ thời gian 144 giờ đến 168 giờ, lượng sinh khối tăng không đáng kể, kết quả này cũng tương tự như công bố của Kim và cs., (2002), Mascarin và cs., (2010) khi thu hồi hệ sợi của Isaria fumosorosea (còn gọi là Paecilomyces fumosorosea), Paecilomyces japonica [99, 123]. Nhằm tiết kiệm thời gian cũng như tính đến lợi ích
101
về mặt kinh tế, thời gian nuôi cấy sẽ dừng lại ở thời điểm 144 giờ và sử dụng để tạo chế phẩm sinh học.
3.3.2. Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh cây hồ tiêu
Để tạo chế phẩm sinh học dạng dịch thể, vấn đề cần thiết là nghiên cứu sự tồn tại của chủng nấm trong chế phẩm. Theo nghiên cứu của Kagimu và cs., (2018) một số cơ chất có khả năng duy trì sự sống của chủng vi sinh vật như than bùn, tinh bột, trấu, cám gạo … được sử dụng tạo chế phẩm [86]. Thí nghiệm được bố trí trên ba công thức nhằm đánh giá khả năng tồn tại của chủng P1 sau thời gian 10 ngày; 30 ngày, 60 ngày. Bào tử bổ sung ban đầu là 1x107/ml. Mẫu đối chứng là môi trường CD cấy bào tử P1. Quan sát, theo dõi sự tồn tại của chủng P1 trên các công thức thí nghiệm như Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khả năng sống sót của chủng P1 trong dịch bảo quản
Công thức Ký hiệu 10 ngày 30 ngày 60 ngày
Bột bắp 5% + Cám gạo 5% + NaCl 0,9%
CM1 (0,3 ± 0,05) x107
(2,4 ± 0,35) x 106
(1,45 ± 0,05) x 106 Tinh bột hồ hóa 20% + Cám
gạo 5% + NaCl 0,9%
CM2 (1,2 ± 0,28) x 108
(5,8 ± 0,36) x 107
(2,31 ± 0,27) x 107 EDTA 1% + Cám gạo 5% +
NaCl 0,9%
CM3 (1,7 ± 0,24) x 104
(1,57 ± 0,18) x 102
(2,34 ± 0,31) x 101 Than bùn 5% + Cám gạo 5%
+ NaCl 0,9%
CM4 (1,52 ± 0,23) x 106
(2,87 ± 0,38) x 106
(1 ± 0,25) x 106 (-): Không sinh trưởng
Theo số liệu ở Bảng 3.6, các chất mang khác nhau có số lượng bào tử nấm khác nhau. Chủng P1 có mật độ bào tử nấm tăng trong giai đoạn 10 ngày đầu và mật độ ổn định trong giai đoạn từ 30 ngày đến 60 ngày trên CM2 (tinh bột hồ hóa 20% + Cám gạo 5% + NaCl 0,9%). EDTA có thể được coi là một chất làm tăng sức mạnh cho thành tế bào của vi sinh vật đồng thời EDTA cũng được coi là chất kháng khuẩn [61]. Nhưng trong trường hợp này CM3 không phù hợp với chủng P1. CM2 có sự
102
khác biệt về số lượng bào tử nấm so với nghiệm thức của CM1, CM4. Đồng thời trên CM1 và CM4 số lượng bào tử nấm không có sự khác biệt nhiều.
Hình 3.18. Sơ đồ quy trình sản xuất dịch thể chế phẩm sinh học
SƠ ĐỒ QUY TRÌNH SẢN XUẤT DỊCH THỂ CHẾ PHẨM SINH HỌC 10 LÍT/MẺ
Hoạt hóa giống (20 ml)
Nhân giống cấp 1 (150 ml)
Nhân sinh khối (2 lít bình lên men 5 lít
Thu hồi sinh khối, lên men xốp 96 h, 30 oC
0,9% NaCl + 5% cám gạo Giống gốc P1
Tinh bột hồ hóa 1%
Thu hồi bào tử
Phối trộn bào tử
Hoàn thành Chế phẩm sinh
học
30 oC, 48 giờ lắc 200 v/phút
30 oC, 24 giờ lắc 200 v/phút Môi trường
CDB, pH7, bình tam giác
CDB, pH7, bình tam giác
1 lít
CDB, pH7, 144 giờ, 30 oC, sục khí 0,5 v/v/phút
Cám gạo 25%;
Xơ dừa 15%
Xơ dừa
Kiểm tra mật độ
103
Mô tả kỹ thuật sản xuất dịch thể vi nấm: Hình 3.18 cho thấy, chủng P1 được hoạt hóa và nuôi cấy trên môi trường CD dịch thể (CDB), pH7, sục khí 0,5 v/v/phút nhiệt độ nuôi cấy là 30 oC. Sau 144 giờ nuôi cấy, sinh khối được phối trộn với cám gạo 25% và mụn xơ dừa 15% đã khử trùng ở 121 oC trong 30 phút, chuyển sang lên men xốp sau 96 giờ, nhiệt độ nuôi cấy 30 oC. Thu nhận bào tử và phối trộn với dung dịch tinh bột 20% đã qua hồ hóa, 5% cám gạo và 0,9% NaCl sao cho đạt mật độ 107 CFU/ml. Chế phẩm dạng dịch thể của chủng P1 được bảo quản ở nhiệt độ 20 oC – 30oC và được kiểm tra mật độ sau các khoảng thời gian bảo quản: 10 ngày, 1 tháng, 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng, 12 tháng, 15 tháng và 18 tháng. Kết quả kiểm tra mật độ trình bày ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khả năng sống sót của chủng P1 trong chế phẩm theo thời gian Thời gian
bảo quản
10 ngày
01 tháng
03 tháng
06 tháng
9 tháng
12 tháng
15 tháng
18 tháng Mật độ (107
CFU/ml)
2,04 ± 0,37
2,12 ± 0,24
1,79 ± 0,28
1,7 ± 0,41
1,2 ± 0,39
0,97 ± 0,25
0,86 ± 0,29
0,84 ± 0,26 Như vậy trong khoảng thời gian 30 ngày, mật độ tế bào có tăng với lượng không đáng kể. Sau 06 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng, mật độ tế bào còn lại trong chế phẩm có suy giảm chút ít, có thể do suy giảm nguồn dinh dưỡng, nhưng các tế bào vẫn còn một lượng nhỏ tinh bột, vi lượng … để tồn tại ở dạng tiềm sinh. Đồng thời chế phẩm cũng được tiến hành thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp. trong vòng 96 giờ cho thấy: chế phẩm làm chết trên 50% số lượng tuyến trùng. Do mật độ nấm suy giảm ít trong quá trình bảo quản, vì vậy chế phẩm vẫn giữ được hoạt tính diệt tuyến trùng.
3.3.3. Nghiên cứu khả năng phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. hại hồ tiêu trong điều kiện nhà lưới của chế phẩm sinh học
Quá trình triển khai thử nghiệm trên đất trồng có ý nghĩa thực tế nhiều hơn trong môi trường lỏng do môi trường đất gần hơn với thực tế thử nghiệm, mô phỏng chính xác hơn so với thử nghiệm trên môi trường dịch thể. Sử dụng đất đỏ bazan:
phân hữu cơ sạch theo tỷ lệ 3:1, đất trộn được xử lý bằng cách trải mỏng, phơi nắng
104
trong 4-5 ngày để tiêu diệt bớt vi sinh vật. Hỗn hợp đất và phân hữu cơ được chia đều vào các chậu trung bình 10 kg/chậu và đưa các chậu vào trong nhà lưới. Cây hồ tiêu (giống Vĩnh Linh) 3,5 tháng tuổi được sử dụng làm thí nghiệm (30 cây/lô). Trong quá trình thử nghiệm luôn luôn duy trì độ ẩm cần thiết cho sinh trưởng của cây và duy trì sự sống của tuyến trùng. Sau khi lây nhiễm, để tuyến trùng ổn định trong thời gian 1- 2 ngày, kiểm tra lại mật độ tuyến trùng có trong 100 g đất. Quá trình thử nghiệm diễn ra trong nhà lưới với nhiệt độ trung bình dao động từ 26 oC đến 29 oC. Kết quả xác định khả năng sống sót của tuyến trùng trong đất, trong rễ, hiệu lực của chế phẩm sinh học (H, %) tuyến trùng sau 10 ngày, 20 ngày, đến ngày thứ 30.
Bảng 3.8. Mật độ tuyến trùng còn sống (MĐTT) và Hiệu lực diệt (HLD) tuyến trùng sau khi xử lý bằng Chế phẩm sinh học trong chậu trồng ở nhà lưới
Công thức MĐTT trước xử lý
MĐTT còn sống và Hiệu lực diệt sau khi xử lý (%)*
Sau 10 ngày Sau 20 ngày Sau 30 ngày
MĐTT HLD MĐTT HLD MĐTT HLD
ĐC1 (không bổ sung tuyến trùng)
100,0
104,7 ±
0,12 0 106,7
± 0,21 0 109,9 ±
0,25 0
ĐC2-(+1) (theo tập quán canh tác)
100,5
80,5 ± 0,18
23,11
± 0,2
73,7 ± 0,19
30,92
± 0,28
60,5 ± 0,15
44,9 ± 0,21 ĐC3-(+2)
(Nokaph)
100,0 82,8 ± 0,24
20.91
± 0,27
77,3 ± 0,15
27,6 ± 0,31
67,3 ± 0,19
38,8 ± 0,32 TN1 (CPSH
pha 50x)
100,7 71,4 ± 0,16
33,27
± 0,25
63,9 ± 0,18
42,77
± 0,18
56,3 ± 0,25
53,57
± 0,27 TN2 (CPSH
pha 100x)
100,0 73,4 ± 0,13
31,23
± 0,29
64,8 ± 0,16
41,84
± 0,14
57,4 ± 0,38
52,48
± 0,18 TN3 (CPSH
pha 150x)
100,3 79,9 ± 0,18
24,8 ± 0,18
71,6 ± 0,21
35,03
± 0,24
64,7 ± 0,28
45,51
± 0,37 TN4 (CPSH
pha 200x)
100,0 82,5 ± 0,22
22,2 ± 0,21
74,9 ± 0,23
31,81
± 0,36
67,5 ± 0,19
42,31
± 0,19 Ghi chú: MĐTT- Mật độ tuyến trùng còn sống (con/100 g đất); HLD: Hiệu lực diệt tuyến trùng của chế phẩm (%).
105
Kết quả Bảng 3.8 cho thấy, tại các thời điểm kiểm tra sau xử lý, mật độ tuyến trùng trong các chậu đối chứng có tăng thêm từ 4,7% đến 9,9%. Trong các chậu thí nghiệm mật độ tuyến trùng còn sống giảm xuống còn 56-82% do tác động của chế phẩm. Hiệu lực diệt tuyến trùng dao động trong khoảng 20-53%. Xét về hiệu lực diệt tuyến trùng ở các mức pha loãng 50 và 100 lần gần giống nhau, còn ở mức 150 và 200 lần hiệu lực giảm hẳn, nên chọn mức pha loãng chế phẩm 100 lần. So sánh với hai mẫu ĐC 2 và ĐC 3 hiệu lực diệt của chế phẩm sinh học ở TN 3 và TN 4 gần tương tự nhau, trong đó mẫu ĐC 3 (chỉ sử dụng 1 loại chế phẩm bán sẵn trên thị trường) cho hiệu lực diệt ít hơn so với ĐC 2 (theo tập quán canh tác của người trồng hồ tiêu).