2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.12. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp
Nhân giống: Từ ống nghiệm giữ giống, P. lilacinus P1 được cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường CDA thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày. Giống được cấy vào bình tam giác, nuôi trên máy lắc (200 v/phút), ở nhiệt độ 28 oC ± 2 oC trong 48 giờ (giống cấp 1).
Lên men P. lilacinus P1 được thực hiện trong bình tam giác 500 ml chứa thể tích 100 ml chất lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút bổ sung 5% giống (v/v). Nghiên cứu các yếu tố bao gồm tỷ lệ chitin, glucose, pepton, K2HPO4, Ca2+/Mg2+. Sau 96 giờ lên men, xác định hoạt tính chitinase. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần và được tính giá trị trung bình.
Khảo sát nguồn nitơ và carbon trong môi trường lên men thu nhận chitinase bổ sung 0,75% chitin cơ chất. Khi nghiên cứu các nguồn carbon, sử dụng nguồn nitơ là 0,5% pepton, thay đổi nguồn carbon với nồng độ 0,5% lần lượt: glucose, maltose, saccarose, lactose, galactose, mannose. Khảo sát nguồn nitơ khi sử dụng nguồn carbon là 2% glucose, thay đổi nguồn nitơ theo pepton, cao thịt, (NH4)2SO4, KNO3, NaNO3 với nồng độ 0,5%. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Điều kiện nuôi cấy P. lilacinus P1 sinh tổng hợp chitinase được khảo sát lần lượt trong các thí nghiệm. Yếu tố khảo sát ở thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm sau.
2.2.12.1. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Xác định hàm lượng tối ưu của 5 yếu tố ảnh hưởng là A (huyền phù chitin), B (glucose) , C (Pepton), D (KH2PO4), E (tỷ lệ Mg2+/Ca2+) bằng cách sử dụng quy hoạch trực giao đối xứng. Hàm đáp ứng được chọn là hoạt tính chitinase (U/ml dịch lên men). Các nghiên cứu tối ưu được tiến hành với thể tích dịch môi trường 50 ml trong
52
bình tam giác dung tích 250 ml ở 28 °C, pH 5,0, trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút.
2.2.12.2. Sàng lọc các yếu tố bằng ma trận Plakett – Burman
Thí nghiệm được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman (1946) [146] để sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase (U/ml). Kết quả nghiên cứu giúp chúng ta xác định được các yếu tố quan trọng có ảnh hưởng trực tiếp tới hàm mục tiêu và loại bỏ những yếu tố ảnh hưởng không đáng kể.
Bảng 2.2. Thiết kế các biến bằng ma trận Plackett-Burman Yếu tố Thành phần
môi trường
Level
(+ 1) (0) (-1)
A Chitin (%) 1,0 0,75 0,5
B Glucose (%) 3,0 2,0 1,0
C Pepton (%) 0,7 0,5 0,3
D K2HPO4 (%) 0,1 0,06 0,01
E Ca2+/Mg2+ (g/g) 1,25 0,75 0,25
Ma trận Plakett – Burman được thiết kế dựa vào tâm thí nghiệm của 5 yếu tố ở thí nghiệm khảo sát. Ma trận được thiết kế với mức thấp (-1) mức trung bình (điểm 0) và mức cao (+1) với α = 1,25 của từng yếu tố tương ứng với phạm vi khảo sát được thực hiện trong thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố bao gồm 63 thí nghiệm để sàng lọc ra các yếu tố ảnh hưởng chính đến hoạt tính chitinase. Các yếu tố có độ tin cậy cao (p<
0,05) sẽ được đưa vào mô hình tối ưu hóa theo phương pháp đáp ứng bề mặt theo cấu trúc có tâm (RSM – CCD).
2.2.12.3. Phương pháp tối ưu hóa bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM)
Phương pháp bề mặt đáp ứng là một kỹ thuật mô hình thực nghiệm được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa một tập hợp của các yếu tố thử nghiệm kiểm soát.
Dựa trên kết quả kiểm tra biến, mô hình kiểm tra các biến thử nghiệm cần thiết cho hoạt tính chitinase tối ưu bằng cách sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng. Sử dụng kỹ thuật mô hình thống kê thực nghiệm để phân tích hồi quy đa điểm. Tập hợp dữ
53
liệu định lượng nhận được từ thiết kế yếu tố nhằm giải đồng thời các phương trình đa biến. Các thành phần môi trường đã lựa chọn có ảnh hưởng đến sinh trưởng được tối ưu hóa sử dụng thiết kế phức hợp tại tâm điểm. Theo thiết kế này, 5 biến được chọn trong thí nghiệm là x1 (glucose), x2 (peptone) , x3 (KH2PO4), x4 (chitin), x5 (tỷ lệ Mg2+/Ca2+) được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng tương tác lẫn nhau đến quá trình sinh trưởng của P. lilacinus P1. Mô hình đã đưa ra 63 thí nghiệm. Các yếu tố kiểm tra được mã hóa theo phương trình sau đây:
xi = i
i
X X X
0
Trong đó:
Xi là giá trị được mã hóa vô hướng của biến số độc lập thứ i, Xi các giá trị tự nhiên của các biến độc lập thứ i;
X0 là các giá trị tự nhiên của các biến độc lập thứ i tại điểm trung tâm;
δXi là giá trị bước thay đổi (bước nhảy).
Phương trình tối ưu các thành phần môi trường được đưa ra dựa trên cơ sở của phương trình bậc hai sau:
Y= β0 + ∑βixi + ∑βiixi2 + ∑βijxj
Trong đó:
Y là kết quả dự đoán;
β0 là giới hạn bị chặn;
βi là hệ số tuyến tính;
βii là hệ số bình phương;
βij là hệ số tương tác qua lại.
Dữ liệu được phân tích bởi phần mềm thống kê Design Expert (DX7 version 7.1, Stat-Dee, Minneapolis, Minnesota. USA). Chất lượng phù hợp của mô hình được đánh giá bằng R2 và Phân tích phương sai (ANOVA). Kiểm tra thống kê của mô hình được thực hiện bằng cách kiểm tra thống kê Fisher. Từ kết quả phân tích xác định mức tối ưu của các yếu tố cho sản lượng chitinase cực đại.