3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp
3.2.5. Sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase, protease và hoạt lực diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. cao
Quá trình nghiên cứu tối ưu chuyển gen vào chủng 424pyrG(-) đã thu được thư viện các thể đột biến do quá trình chèn T-DNA trong quá trình chuyển gen và chúng có thể được sử dụng để sàng lọc các thể đột biến liên quan đến khả năng sinh chitinase, protease cũng như diệt tuyến trùng.
Năm trăm thể chuyển gen được xác định hoạt tính chitinase và được sàng lọc (Phụ lục 2). Kết quả trên Hình 3.15A cho thấy thể chuyển gen PE858 cho hoạt tính chitinase cao gấp 11,7 lần (722,28 U/ml và 61,7 U/ml) so với chủng tự nhiên (WT).
Nhóm A (các thể chuyển gen có hoạt tính chitinase dao động từ 23,7 U/ml đến 35,4 U/ml) tức là thấp hơn chủng tự nhiên P1 (WT) chiếm tỷ lệ 65,4%, nhóm B (các thể chuyển gen có hoạt tính dao động từ 68,85 U/ml đến 88,01 U/ml) tức là cao hơn chủng tự nhiên P1 (WT) khoảng 1,2 lần chiếm tỷ lệ 15,3%. Nhóm C (các thể chuyển gen có hoạt tính dao động từ 98,3 U/ml đến 133,4 U/ml) tức là cao hơn chủng tự nhiên P1 (WT) khoảng 2 lần chiếm tỷ lệ 19,2%. Như vậy, thể chuyển gen PE858 và nhóm C tiếp tục được sàng lọc và xác định hoạt tính protease. Hoạt tính protease gần 100 thể chuyển gen của nhóm C được trình bày ở Hình 3.15B. PE858 có hoạt tính protease gấp 1,8 lần so với chủng tự nhiên P1 (WT), tiếp theo là nhóm C2 (có hoạt tính từ 109,9 U/ml đến 158,4 U/ml) chiếm 7,7% cao xấp xỉ so với PE858. Nhóm C3 có hoạt tính tương đương với chủng tự nhiên P1 (WT) chiếm 23,9% và nhóm C1 có hoạt tính thấp hơn hẳn so với chủng tự nhiên P1 (WT) chiếm 68,4%. Lý do các chủng đột biến này có sự thay đổi hoạt tính sinh tổng hợp chitinase, protease có thể do quá trình chuyển gen DsRed vào 424pyrG(-), gen DsRed nằm trong vùng T-DNA đã được
98
chèn ngẫu nhiên vào một trong các gen hoặc đoạn gen liên quan dẫn đến bất hoạt các gen này ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase. Những đoạn gen sai hỏng này là các đối tượng tiềm năng cho nghiên cứu chức năng gen ở P. lilacinus.
Từ những kết quả chọn lọc ở trên, thể chuyển gen PE858 được thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng Meloidogyne sp. như phương pháp 2.2.13.5.
Hình 3.15. Hoạt tính chitinase và protease của các thể chuyển gen và chủng P1, A. Hoạt tính chitinase, B. Hoạt tính protease.
Kết quả thử nghiệm cho thấy trong vòng 48 giờ, dịch nuôi cấy PE858 cho tỷ lệ tuyến trùng Meloidogyne sp. bị chết lên đến 72%, trong đó chủng tự nhiên (P1) cho tỷ lệ chết 11%. Điều đó chứng tỏ hoạt tính chitinase cao ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ diệt tuyến trùng.
Hình 3.15 cho thấy ở mẫu đối chứng (ĐC) là nước cất, tuyến trùng chết tự nhiên xấp xỉ 1%, thể chuyển gen PE858 cho tốc độ diệt tuyến trùng Meloidogyne sp.
nhanh gấp 7 lần sau 48 giờ so với chủng P1 (WT). Đồng thời quan sát dưới kính hiển vi điện tử, sự phân nhánh hệ sợi của PE858 nhiều hơn rõ rệt so với WT (Phụ lục 2).
Như vậy, ở PE858 đã có việc chèn T-DNA ngẫu nhiên vào các gen điều hòa hoặc vào vị trí nhằm kích hoạt biểu hiện một số gen tham gia vào cơ chế diệt tuyến trùng. Việc cải biến di truyền tạo các thể đột biến cho khả năng diệt tuyến trùng cao ở chủng P1 mở ra hướng nghiên cứu mới nhằm điều tra vai trò, chức năng của các gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng cũng như các gen tham gia vào quá trình trao đổi chất của chủng nấm sợi tiềm năng này.
99
Hình 3.16. Tỷ lệ chết của tuyến trùng A. Hình ảnh tuyến trùng sống B. Hình ảnh tuyến trùng chết C. Đồ thị tỷ lệ chết của tuyến trùng. (Ghi chú: hình A, B được chụp trên KHV Olympus CX 41 độ phóng đại 150x)
Những kết quả trên có ý nghĩa lớn về mặt khoa học đồng thời có thể sản xuất chitinase để phối trộn vào chế phẩm nhằm tăng hiệu lực diệt. Việc sử dụng chủng đột biến để ứng dụng tạo chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng tại Việt Nam còn gặp phải nhiều vấn đề về mặt pháp lý.
Nhằm giải quyết tính cấp thiết là tạo chế phẩm và áp dụng thử nghiệm thực tế chế phẩm sinh học diệt tuyến trùng trên cây hồ tiêu khu vực Tây Nguyên, nhóm nghiên cứu tiến hành tạo chế phẩm sinh học có sử dụng chủng nấm P1 tự nhiên. Quá trình tạo chế phẩm, thử nghiệm chế phẩm là một phần nội dung của Hợp đồng số 07/16-ĐTĐL.CN-CNN ngày 10/6/2016 giữa Bộ Khoa học và Công nghệ với Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với tên đề tài
“Ứng dụng công nghệ nano sản xuất chế phẩm sinh học dạng dịch thể từ vi sinh vật và thảo mộc phòng trừ tuyến trùng và bệnh rễ cây hồ tiêu ở Tây Nguyên” - Mã số ĐTĐL.CN-07/16. Công ty Cổ phần Nicotex kết hợp với Viện Công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm. Năm 2018 đã hoàn thiện quy trình tại công ty và nhiệm vụ đặt ra là triển khai mô hình, xây dựng quy trình sử dụng các chế phẩm để có các biện pháp quản lý tổng hợp bệnh tuyến trùng, nấm gây hại rễ cây hồ tiêu áp dụng cho tỉnh Đăk Lăk.
100