2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.11. Phương pháp chuyển gen vào nấm sợi thông qua Agrobacterium
2.2.11.1. Biến nạp vector pEX2A vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1
Chủng AGL1 là chủng vi khuẩn đã được cải biến di truyền từ chủng A.
tumefaciens AGL0. Hệ gen của chủng AGL1 đã được loại bỏ đi vùng chứa các gen gây khối u, nhờ đó tạo điều kiện cho việc phát triển các vector nhị thể chứa vùng gen thay thế mong muốn. Vector pEX2A được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phương pháp xung điện [141] bao gồm các bước sau: (1) Chuẩn bị tế bào A. tumefaciens AGL1 khả biến: chọn 1 khuẩn lạc đơn vi khuẩn AGL1 trong đĩa cấy sang bình tam giác có chứa 50 ml LB dịch thể (bổ sung kanamycin nồng độ 100 mg/L, tốc độ lắc 200 v/phút, 28 oC trong 15-18 giờ. (2) Ly tâm dịch nuôi 5000 vòng/phút ở 4 oC thời gian 10 phút. (3) Thu tủa và rửa tủa bằng dung dịch HEPES 100 mM và một lần bằng dung dịch glycerol 10%. (4) Ly tâm dung dịch ở nhiệt độ 4 oC, 4000 v/phút trong thời gian 10 phút và đổ bỏ dịch sau mỗi lần rửa. (5) Hòa cặn tế bào trong 1 ml glycerol 10% sau đú chia vào cỏc ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 50 àl. (6) Cỏc ống chứa tế bào AGL1 khả biến được bảo quản trong tủ (-30 oC) hoặc có thể sử dụng ngay để biến nạp bằng xung điện. Quy trình biến nạp: Vector được biến nạp vào chủng A. tumefaciens AGL1 bằng phương phỏp xung điện. Trộn 0,5 àl vector vào ống chứa 50 àl tế bào A. tumefaciens AGL1 khả biến. Hỳt toàn bộ dịch chuyển vào cuvet 2 mm và đặt trên nước đá. Biến nạp bằng xung điện sử dụng máy chuyển gen xung điện Bio-Rad với cỏc thụng số của chương trỡnh là 2,5 kV; 400 Ω; 25 àF, cuvet
49
2 mm. Sau khi bắn xung điện, hỗn hợp được chuyển sang ống eppendorf 2 ml và bổ sung thờm 500 àl mụi trường LB lỏng và lắc 1 giờ ở 28 oC, tốc độ lắc 200 v/phỳt (tránh lắc với tốc độ 250 – 300 v/phút gây chết tế bào). Thu tế bào vi khuẩn bằng ly tâm tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 giây, đổ bỏ dịch, hòa tế bào vào phần dịch còn lại và cấy trải trên môi trường LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l). Đĩa nuôi cấy được ủ ở 28 oC trong 72 giờ để thu nhận các khuẩn lạc riêng rẽ. Các khuẩn lạc sau đó được kiểm tra bằng PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu tương ứng với các gen có mặt trong vector (Phụ lục 1).
2.2.11.2. Tối ưu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen ở thể đột biến 424pyrG(-)
Vector pEX2A được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 bằng phương pháp xung điện. Chủng AGL1 mang vector pEX2A sẽ được chuyển vào thể đột biến 424pyrG(-). Tối ưu quy trình chuyển gen vào các loài nấm sợi đã được các nhà khoa học công bố trước đây [44, 109, 133, 136].
A. tumerfaciens AGL1 mang gen chỉ thị DsRed sau đó được nuôi cấy trong mụi trường lỏng LB chứa kanamycin 100 àg/ml, nhiệt độ nuụi cấy 28 oC, tốc độ lắc 200 vũng/phỳt. Hỗn hợp IM lỏng (được bổ sung 200 àM acetosyringone (AS): dịch vi khuẩn nuôi cấy ở trên theo tỷ lệ: 1: 9 được nuôi cấy lắc ở nhiệt độ 28oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thời gian nuôi cấy 6 h, trong điều kiện tránh ánh sáng để OD đo ở bước sóng 600 nm đạt 0,8 là đạt yêu cầu chuyển gen. Một hỗn hợp bao gồm 100 μl môi trường nuôi cấy A. tumefaciens trộn với 100 μl huyền phù bào tử nấm (105, 106 hoặc 107 bào tử/ml) đã được lọc trên giấy lọc, mã: FT-3-303-090 (Sartorius, Gửttingen , Đức), đặt trờn đĩa thạch IM cú bổ sung 0,005% uridine hoặc 0,005% uracil hoặc 0,001% uridine hoặc 0,001% uracil chứa AS (100, 200, 300 àM).
Các điều kiện tối ưu được lựa chọn như sau: khoảng thời gian đồng nuôi cấy khác nhau (48, 60, 72 giờ) và nhiệt độ đồng nuôi cấy khác nhau (20, 22, 25 °C) đã được thử nghiệm. Các màng lọc được chuyển vào các đĩa CDA được bổ sung cefotaxime (300 g/ml) để lựa chọn các thể chuyển gen đồng thời loại bỏ các tế bào Agrobacterium. Các màng được ủ ở nhiệt độ 25 oC đến 28 °C trong thời gian từ 4 đến
50
5 ngày. Sau đó các khuẩn lạc nấm xuất hiện trên đĩa môi trường chọn lọc, quan sát sự sinh trưởng và đếm các khuẩn lạc.
Quy trình chuyển gen huỳnh quang DsRed vào thể đột biến 424pyrG(-) bằng A. tumefaciens AGL1 được thực hiện theo các bước sau (1) Nuôi cấy lắc 200 v/phút A. tumefaciens AGL1 (đã biến nạp vector PEX2A) trên môi trường LB có bổ sung kanamycin (100 àg/ml) ở 28 oC, (2) Lắc A. tumefaciens AGL1 trờn mụi trường IM cú bổ sung AS (100 àg/ml) ở 25 oC – 28 oC trong 6 giờ, 200 v/phỳt. Đo OD ở bước sóng 600 nm trước và sau khi nuôi cấy, (3) Trộn đều dịch bào tử và dịch nuôi cấy, đo OD ở 600 nm, (4) Đưa màng lọc vào đĩa Petri chứa IM 0,001% uracil hoặc 0,001%
uridine, 0,005% uracil, 0,005% uridine, cú bổ sung AS với nồng độ 100 – 300 àM), hỳt 200 àL trải đều lờn màng, (5) Quỏ trỡnh đồng nuụi cấy trong thời gian 48, 60, 72 giờ (tùy thuộc), nhiệt độ đồng nuôi cấy 20 oC hoặc 22 oC hoặc 25 oC, (6) Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển màng sang môi trường CDA và nuôi cấy ở nhiệt độ 28
oC ± 2 oC, thời gian từ 3 đến 5 ngày, (7) Những khuẩn lạc mọc được trên CDA tối thiểu là những thể chuyển gen đã nhận được gen, làm sạch khuẩn lạc, lưu giữ các thể chuyển gen.
2.2.11.3. Xác nhận biểu hiện gen DsRed của các thể chuyển gen
Các thể chuyển gen mọc trên môi trường CDA tối thiểu bằng cách phân lập từ bào tử đơn trong năm thế hệ kế tiếp để kiểm tra sự ổn định của quá trình phân bào.
Những chủng này sau đó được nuôi cấy trong môi trường CD dịch thể để thu hệ sợi và tách DNA hệ gen. Sự tích hợp T-DNA vào hệ gen của các thể chuyển gen đã được xác định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen DsRed và AnpyrG_ORF, sử dụng GoTaq Green Master Mix (Promega, USA). Để kiểm tra biểu hiện gen huỳnh quang, các thể chuyển gen được nuôi trên một phiến kính vô trùng có chứa một giọt môi trường CDA, sau đó được phủ bằng lamen trên môi trường thạch, mẫu được ép nhẹ nhàng. Lam kính được đưa vào nuôi cấy trên đĩa Petri vô trùng có chứa một số mảnh giấy đã được làm ướt trong 48 giờ, ở 30 oC. Lam kính nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Axioplan (Carl Zeiss, Đức) tín hiệu cho huỳnh quang đỏ.
51
2.2.11.4. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease ngoại bào, khả năng diệt tuyến trùng của các thể chuyển gen.
Năm trăm thể chuyển gen được tiến hành sàng lọc, nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase và protease ngoại bào và khả năng diệt tuyến trùng.