3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp
3.2.4. Xác nhận biểu hiện gen DsRed ở các thể chuyển gen
Vector pEX2A được biến nạp vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng xung điện [161]. Sau 3-5 ngày chuyển màng, nuôi cấy ở nhiệt độ 28 oC, các khuẩn lạc chuyển gen xuất hiện. Nuôi cấy quan sát hình thái khuẩn lạc các thể chuyển gen trên môi trường CDA và CDA có bổ sung 0,005% uridine và 0,005% uracil. Tiến hành xác nhận các thể chuyển gen bằng cách nuôi cấy thu sợi và tách chiết DNA của các thể chuyển gen. Phản ứng PCR được thực hiện với những cặp mồi đặc hiệu.
Kết quả so sánh hình thái, màu sắc khuẩn lạc của các thể chuyển gen (ký hiệu là PE1 – PE5) cho thấy các thể chuyển gen và chủng tự nhiên không có sự khác biệt (hình 3.14A).
95
Hình 3.14. Xác nhận thể chuyển gen biểu hiện huỳnh quang đỏ DsRed từ 424pyrG(-) chủng P. lilacinus P1.
Ghi chú: A. Kết quả chuyển gen DsRed bằng vector pEX2A vào thể đột biến 424 pyrG (-) chủng P. lilacinus P1 và sàng lọc ngẫu nhiên 5 chủng chuyển gen (từ PE1 đến PE5) trên môi trường CD có bổ sung 0,005% uridine, uracil đồng thời trên môi trường CD tối thiểu. B. Xác nhận các thể chuyển gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi AnpyrG_ORF-F/AnpyrG_ORF- R và cặp mồi DsRed-F/DsRed-R. C. Năm thể chuyển gen DsRed (từ PE1 đến PE5) được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
96
Gen GFP, DsRed là gen chỉ thị huỳnh quang xanh và huỳnh quang đỏ được sử dụng phổ biến trong chuyển gen ở nấm và được biểu hiện thành công ở các loài nấm khác nhau [105, 136]. Khi tế bào nấm nhận được gen DsRed sẽ xuất hiện màu đỏ dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng phù hợp [57, 83, 134]. Trong nghiên cứu này, các thí nghiệm được tiến hành chuyển gen DsRed vào thể đột biến 424 pyrG (-) chủng P1 bằng phương pháp ATMT. Thí nghiệm được tiến hành với vector pEX2A, thiết kế theo nghiên cứu của Nguyen và cs., (2016), Tao Xuan Vu và cs., (2019) với marker gpdA và promotor là AnpyrG từ Aspergillus niger [136, 179].
Năm thể chuyển gen DsRed thu được từ 424 pyrG(-) đã được cấy trên môi trường tối thiểu CDA; nhiệt độ nuôi cấy 30 oC trong thời gian 3 ngày để tiến hành thu hệ sợi nấm sử dụng cho tách chiết DNA. Khi gen pyrG được đưa trở lại các chủng đột biến này, các thể chuyển gen sinh trưởng bình thường. Sự tích hợp của gen chỉ thị DsRed (729 bp) vào bộ gen được xác định bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu DsRedF/DsRedR (729 bp); AnPyrG_ORFF/AnPyrG_ORFR (1005 bp). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,7%. Kết quả PCR cho thấy gen DsRed và gen marker AnpyrG đều đã được tích hợp vào trong bộ gen của các thể chuyển gen (từ PE1 đến PE5) (Hình 3.14B).
Kết quả được trình bày ở Hình 3.14C cho thấy băng 729 bp và băng 1005 bp xuất hiện trên bản điện di điều đó chính tỏ rằng gen DsRed và AnpyrG đã được chuyển vào thể đột biến 424pyrG(-).
Đồng thời kết quả Hình 3.14C khi làm tiêu bản hệ sợi dưới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy gen DsRed đã được biểu hiện thành công ở P. lilacinus P1 thông qua tín hiệu huỳnh quang đỏ. Điều đó chứng tỏ rằng, hệ thống chuyển gen mới thiết lập cho hiệu quả biểu hiện gen tốt, cho tới nay DsRed chưa từng được biểu hiện ở Paecilomyces, mở ra triển vọng nghiên cứu vai trò của một số gen liên quan đến cơ chế diệt tuyến trùng trong tương lai. Urquhart và cs., (2018) đã chuyển gen và biểu hiện thành công gen GFP vào P. variotii CBS 101075 bằng phương pháp ATMT nhằm mục đích nghiên cứu chức năng một số gen trong đó có gen leuA [174].
97
Kết quả nghiên cứu cho thấy, gen huỳnh quang đỏ DsRed đã được biểu hiện thành công ở chủng 424pyrG(-). Các khuẩn lạc chuyển gen được tiến hành cấy chuyền, thuần khiết, lưu giữ chủng. Việc tạo ra ngân hàng các thể chuyển gen có vai trò quan trọng trong nghiên cứu sàng lọc các thể chuyển gen có hoạt lực diệt tuyến trùng cao, mở ra triển vọng mới cho nghiên cứu biểu hiện protein, enzym tái tổ hợp cũng như sản xuất các chất có hoạt tính sinh học ở nấm P. lilacinus.