3.1. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp
3.2.3. Xây dựng quy trình chuyển gen tối ưu vào 424 pyrG(-)
Để tăng cường hiệu quả quá trình chuyển gen bằng phương pháp ATMT, phân tích các thông số ảnh hưởng đến quá trình này đã được thực hiện như: nồng độ uridine, uracil, nhiệt độ đồng nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ AS, mật độ bào tử chuyển gen. Nhằm đánh giá khả năng phục hồi sinh trưởng, môi trường đồng nuôi cấy có thành phần sau: IM + 0,001% uracil; IM + 0,001% uridine; IM + 0,005%
uidine; IM + 0,005% uracil đã được sử dụng. Nhiệt độ đồng nuôi cấy là nhân tố quan trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình chuyển gen đối với chủng nấm sợi theo các công bố trước đây dao động từ 20
oC đến 25 oC [46, 127, 201]. Thời gian đồng nuôi cấy trong điều kiện không chiếu sáng và được thay đổi trong khoảng thời gian từ 48 – 72 giờ. Các công bố trước đây của Bundock và cs., (1995), Michielse và cs., (2005) khẳng định AS là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển T-DNA và tích hợp gen vir vào tế bào nấm cần chuyển [30, 127].
92
Hình 3.12. Điều kiện được lựa chọn tối ưu cho quá trình chuyển gen (Nồng độ uridine, nồng độ uracil, thời gian đồng nuôi cấy, nhiệt độ đồng nuôi cấy, nồng độ
AS, nồng độ bào tử thể đột biến 424pyrG(-) của chủng P1)
Nồng độ AS được thay đổi từ 100 àM, 200 àM, 300 àM. Cỏc đĩa cú phủ màng cellulose (mã số FT 3-3-3-085 hoặc FT-3-303-090, Satorius) sau thời gian đồng nuôi cấy được chuyển sang môi trường CDA có bổ sung kháng sinh cefotaxime (300 mg/ml). Sau khi ủ đĩa từ 3-5 ngày ở nhiệt độ 25 oC – 28 oC trên đĩa môi trường chọn lọc xuất hiện các khuẩn lạc nấm chuyển gen.
Kết quả được trình bày ở Hình 3.12 cho thấy, hiệu quả chuyển gen cao nhất đạt được tới 2873 ± 224 thể chuyển gen/106 bào tử với nồng độ uridine là 0,005%, thời gian đồng nuôi cấy 60 giờ, nhiệt độ đồng nuôi cấy 22 oC, nồng độ bào tử sử dụng cho quỏ trỡnh chuyển gen 106/ml, nồng độ AS là 200 àM. Kết quả này gấp 10 lần so với nồng độ uridine 0,001%, gấp ba lần so với nồng độ uracil 0,005%. Số lượng thể chuyển gen sau 60 giờ đồng nuôi cấy gấp hai lần so với nhiệt độ đồng nuôi cấy ở 48 giờ. Nhiệt độ đồng nuôi cấy ở 22 oC cho số lượng thể chuyển gen gấp 5 lần so với nhiệt độ đồng nuôi cấy ở 20 oC, ở nhiệt độ đồng nuôi cấy 24 oC và 25 oC số lượng vi
93
khuẩn mọc nhiều lấn át thể chuyển gen vì vậy không có số liệu. Kết quả tối ưu cho thấy, ở nồng độ AS 200 àM số lượng thể chuyển gen gấp hai lần so với nồng độ AS 100 àM và gấp 4,5 lần số lượng thể chuyển gen ở nồng độ AS là 300 àM. Điều này chứng tỏ ở nồng độ AS cao, số lượng vi khuẩn A. tumefaciens bị diệt nhiều. Đối với mật độ bào tử 107/ml cho hiện tượng mọc nền trên màng nuôi cấy, không phân biệt thể chuyển gen riêng biệt.
Theo cỏc nghiờn cứu của Yang và cs., (2015), quỏ trỡnh chuyển gen ò-tubulin bằng phương pháp ATMT được tiến hành ở P. lilacinus 36-1 và tối ưu hóa các điều kiện như thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ AS, nồng độ bào tử… cuối cùng đạt hiệu quả là 256 thể chuyển gen với nồng độ bào tử khi chuyển gen 106 bào tử /ml; đạt 186 thể chuyển gen khi chuyển gen bar với thời gian đồng nuôi cấy 54 giờ; nhiệt độ đồng nuụi cấy 25 oC; nồng độ AS là 250 àg/ml; mật độ bào tử là 106 bào tử/ml [203]. Lima I. và cs., (2006) cho hiệu quả chuyển gen đạt 58,3 ± 18,5, 98,3 ± 24,8 và 169,7 ± 35,5 thể chuyển gen/105; 106 và 107 bào tử khi sử dụng A. tumerfaciens vào Paecilomyces fumosoroseus [112]. Chaves B. và cs., (1997) đã chuyển gen bằng phương pháp tế bào trần vào P. fumosoroseus, hiệu suất của quá trình chuyển gen cho 1,9 đến 2,5 thể chuyển gen/àg DNA [37]. Lima G., và cs., (2006) đó chuyển gen bằng A.
tumerfaciens vào P. fumosoroseus cho hiệu quả chuyển gen 169,7±35,5 thể chuyển gen/107 bào tử [112]. Trong nghiên cứu này, kết quả của luận án cho số lượng thể chuyển gen sau khi tối ưu các điều kiện nhiều gấp 10 lần so với kết quả của Yang và cs., (2015) và cao hơn rất nhiều lần so với công bố của Lima I. và cs., (2006), Chaves B. và cs., (2007), Lima G., và cs., (2006).
Cải biến di truyền ở chủng P1 bằng phương pháp chuyển gen ATMT sử dụng marker trợ dưỡng là một bước tiến vượt trội đồng thời thí nghiệm đã chuyển gen thành công gen DsRed vào thể đột biến 424pyrG(-) chủng P1 với các thông số tối ưu là nồng độ uridine bổ sung cho môi trường IM đồng nuôi cấy là 0,005%; nồng độ bào tử cho chuyển gen là 106 bào tử/ml; nhiệt độ đồng nuôi cấy là 22 oC; nồng độ AS cho giai đoạn cảm ứng là 200 àM AS; thời gian đồng nuụi cấy là 60 giờ (Hỡnh 3.13).
94
Hình 3.13. Quy trình chuyển gen bằng phương pháp ATMT của thể đột biến 424pyrG(-) sử dụng vectơ nhị thể pEX2A với marker pyrG.