CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.2 Nội dung 2: Xác định nhu cầu dinh dưỡng của cá kèo
3.4.2.1 Ứng dụng mô hình năng lượng sinh học xác định nhu cầu năng lượng và
Thí nghiệm 1: Xác định năng lượng và protein duy trì của cá kèo
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức tương ứng với 4 nhóm kích cỡ cá khác nhau (3,63±0,15 g; 5,86±0,06 g; 14,2±0,06 g và 20,0±0,15g) được bố trí với mật độ 30 con/ bể và mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với thời gian thí nghiệm là 28 ngày. Cá kèo ở tất cả các nghiệm thức không được cho ăn trong suốt quá trình thí nghiệm.Nhiệt độ trong các bể sáng chiều dao động từ 27,8–29,7; pH nước dao động từ 7,3–7,5. Các chỉ tiêu cần xác định như: tỷ lệ sống, khối lượng cá tiêu hao, năng lượng tiêu hao, protein tiêu hao và thành phần hóa học của cá.
37
Hình 3.3: Bốn kích cỡ cá kèovà hệ thống bể bố trí thí nghiệm 1
Khối lượng cá tiêu hao, năng lượng tiêu hao, protein tiêu hao được xác định như sau:
- Khối lượng cá tiêu hao = W0 - Wt
Trong đó: W0: Khối lượng của cá khi thí nghiệm Wt: Khối lượng của cá khi kết thúc thí nghiệm - Năng lượng (E) tiêu hao
Etiêu hao đi = (W0 x E0 - Wt x Et)/ T
Trong đó: Etiêu hao đi : Năng lượng tiêu hao của cá (kJ/kg cá/ngày) E0: Năng lượng của cá thí nghiệm (kJ/kg cá)
Et : Năng lượng của cá khi kết thúc thí nghiệm (kJ/kg cá) T: Thời gian thí nghiệm (ngày)
- Protein (P) tiêu hao
Ptiêu hao đi = (W0 x P0 - Wt x Pt)/ T
Trong đó: Ptiêu hao đi : Protein tiêu hao của cá (g/kg cá/ngày) P0: Hàm lượng protein của cá khi thí nghiệm (g/kg cá)
P0: Hàm lượng protein của cá khi kết thúc thí nghiệm (g/kg cá) - Tương quan giữa năng lượng, protein tiêu hao và khối lượng của cá được thể hiện bằng phương trình: y = axb (Lupatsch et al., 2001)
Trong đó: y là protein hoặc năng lượng tiêu hao
x: khối lượng trung bình nhân của cá (Geometric Mean Body Weight – GMW) GMW = (Wt x Wo)0,5
a: năng lượng, protein tiêu hao hàng ngày của cá b: hệ số trao đổi năng lượng, protein
38
Thí nghiệm 2: Xác định khả năng tiêu hóa thức ăn và các dưỡng chất có trong thức ăn cho cá kèo
Thức ăn thí nghiệm
Thức ăn được được phối trộn từ các nguyên liệu gồm bột cá Kiên Giang, bánh dầu nành ly trích dầu, bột mì, cám gạo, chất kết dính, dầu cá, vitamin, khoáng.
Đồng thời, thức ăn còn sử dụng chất đánh dấu chromic oxide (Cr2O3) với tỷ lệ 1% (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Nguyên liệu và thành phần hóa học của thức ăn
Nguyên liệu Tỷ lệ (%)
Bột cá 18,4
Bánh dầu nành ly trích 28,1
Bột mì 33,8
Cám 15,7
Chất kết dính 1
Dầu cá 1
Premix vitamin, khoáng 1
Cr2O3 1
Thành phần hóa học (% khối lượng khô)
Ẩm độ 8,10
Protein 33,6
Lipid 5,37
Xơ 4,05
Tro 12,5
NFE 44,5
Năng lượng thô (KJ/g) 16,3
39
Hình 3.4: Cá đầu vào và thức ăn thí nghiệm 2 Bố trí thí nghiệm
Cá có khối lượng trung bình 7,40±0,26 g/con được bố trí với mật độ 50 con/ bể trong 3 bể nhựa (70L/ bể). Bể được thiết kế nước chảy tràn và sục khí liên tục.
Thí nghiệm kết thúc khi thu đủ lượng phân cần phân tích (3–5g phân khô).
Trước khi tiến hành thu phân, cá được cho ăn 2 lần/ ngày vào lúc 7h30 và 13h trong 7 ngày cho cá tiêu hóa tốt thức ăn. Ngày thứ 8 bắt đầu thu phân. Cá được cho ăn trên sàng và cho ăn thỏa mãn theo nhu cầu. Rổ nhựa được sử dụng làm sàng cho cá có hình chữ nhật (23 cm x 17 cm), xungquanh sàng ăn được may bao bọc bằng lưới để giữ viên thức ăn và được treo cách mặt nước 10 cm.
Hình 3.5: Bể bố trí thí nghiệm 2 Cách thu và xử lý phân
Sau khi cho cá ăn được 1 giờ loại bỏ hết phân, thức ăn thừa và thay nước với tỷ lệ 70% thể tích nước trong bể. Sau đó tiến hành thu phân bằng ống nhựa, dùng ống nhựa siphon phân ra ngoài (phân dạng sợi), sau đó rửa lại với nước cất và trữ
40
lạnh trong chai nhựa (ở 4oC). Mẫu phân tươi của cá được sấy khô trong tủ sấy với nhiệt độ (ở 60oC trong 24giờ) trước khi phân tích thành phần hóa học trong mẫu phân.
Các chỉ tiêu cần xác định như: thành phần hóa học của nguyên liệu, thức ăn và mẫu phân của cá kèo, Cr2O3, độ tiêu hóa vật chất khô, protein và năng lượng trong thức ăn.
Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả sử dụng năng lượng và protein của cá kèo Trước khi bố trí thí nghiệm chính thức, cá được bố trí thí nghiệm thăm dò bằng cách cho cá ăn 3 lần/ ngày (ăn thỏa mãn nhu cầu) trong 7 ngày và đã xác định mức ăn tối đa của cá là và được xác định là 6% khối lượng thân.
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức tương ứng với các mức choăn là 0%; 1,5%; 3,0%; 4,5% và 6,0% khối lượng thân/ ngày. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần với mật độ cá bố trí là 30 con/bể. Thời gian tiến hành là 28 ngày. Thức ăn được sử dụng giống thức ăn thí nghiệm 2. Cá bố trí thí nghiệm có khối lượng trung bình là 3,31±0,01g/con và được cho ăn 3 lần/ ngày (7h30, 11h30, 16h) với các mức cho ăn tương ứng với từng nghiệm thức. Đồng thời, trong quá trình thí nghiệm cá được thay nước định kỳ 3 ngày/ lần, mỗi lần thay 30% thể tích nước trong bể. Nhiệt độ nước trong các bể thí nghiệm dao động từ 27,5 đến 29,6oC; pH nước dao động từ 7,4–7,6.
Các chỉ tiêu cần xác định như: thành phần hóa học thức ăn và cá kèo, tỷ lệ sống, tăng trưởng, tốc độ tăng trưởng tuyệt đối, tốc độ tăng trưởng tương đối, hệ số thức ăn, nhu cầu năng lượng (E) và nhu cầu protein (P) duy trì, hiệu quả sử dụng E và hiệu quả sử dụng P.
Hình 3.6: Cá đầu vào và hệ thống bể thí nghiệm 3
Nhu cầu năng lượng (E) và nhu cầu protein (P) duy trì, hiệu quả sử dụng E và hiệu quả sử dụng P được được xác định như sau:
- Nhu cầu E và P duy trì, hiệu quả sử dụng E và P được xác định theo phương pháp của NRC (2011) dựa trên phương trình: y = ax + b
41 Với: y = năng lượng hoặc protein tích lũy a = hiệu quả sử dụng năng lượng, protein x = năng lượng hoặc protein tiêu hóa ăn vào
Nhu cầu năng lượng và protein duy trì được xác định tại y = 0 - Xác định nhu cầu năng lượng và protein của cá kèo
Nhu cầu năng lượng và protein của cá kèo được xác định dựa trên mô hình hóa bao gồm các yếu tố: khả năng tăng trưởng (y = axb), yêu cầu về năng lượng cho duy trì và tăng trưởng, hiệu quả sử dụng năng lượng và protein (y = ax+b) (Lupatsch, 2001; Glencross, 2006; Glencross et al., 2010; Trung et al., 2011).
3.4.2.2 Xác định nhu cầu lipid, tỷ lệ carbohydrate/lipid (CHO:L) và hiệu quả sử dụng các nguồn lipid khác nhau
Xác định nhu cầu lipid, tỷ lệ CHO:L và hiệu quả sử dụng các nguồn lipid khác nhaucủa cá kèo dựa trên kết quả nghiên cứu xây dựng nhu cầu protein và năng lượng gồm hai thí nghiệm.
Thí nghiệm 4: Xác định nhu cầu lipid của cá kèo và tỷ lệ CHO/L thích hợp trong thức ăn
- Thức ăn thí nghiệm
Lipid trong nguyên liệu bột cá được loại bỏ bằng dung dịch petrolyum ether trước khi chế biến thức ăn. Cho dung dịch petrolyum ether vào ngập bột cá, sau đó trộn cho ngấm đều rồi để yên khoảng 24 giờ. Sau đó, loại bỏ dung dịch này và tiếp tục cho dung dịch petrolyum ether mới vào. Lặp lại 4–5, sau đó lấy mẫu bột cá (đã ly trích béo) sấy khô ở 60oC để loại petrolyum ether trong 24 giờ.
Sau quá trình li trích, tiến hành phân tích hàm lượng lipid trong bột cá, nếu lipid nhỏ hơn 1% thì tiếp tục phân tích các thành phần còn lại (protein, xơ, tro), ngược lại ta thực hiện lại các bước như trên để loại bỏ lipid trước khi phối chế thức ăn thí nghiệm.
Thức ăn thí nghiệm được phối trộn từ các loại nguyên liệu chính: bột cá (đã ly trích béo), bánh dầu nành (đã ly trích béo), bột mì tinh, dầu cá, dầu đậu nành, hỗn hợp khoáng-vitamin và CMC (Bảng 3.5).
42
Bảng 3.5: Tỷ lệ nguyên liệu và thành phần hóa học của thức ăn thí nghiệm 4
Nguyên liệu (%) Nghiệm thức (% lipid)
1,50 4,50 7,50 10,5 13,5
Bột cá(1) 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Bánh dầu nành ly trích 54,5 55,0 55,5 56,0 56,5
Bột mì 30,3 23,0 15,8 8,54 1,29
Dầu đậu nành (2) 0 1,26 2,78 4,31 5,83
Dầu cá biển (3) 0,41 1,91 3,41 4,91 6,41
Khoáng – Vitamin (4) 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
Chất kết dính 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
CMC (5) 2,09 5,79 9,5 13,2 16,9
Thành phần hóa học (% khối lượng khô)
Ẩm độ 10,1 10,7 10,2 10,6 10,6
Protein 34,8 36,6 35,4 35,7 36,6
Lipid 1,37 4,53 7,20 10,4 13,5
Tro 7,38 7,41 8,47 9,39 10,1
Xơ 4,15 4,91 5,94 6,94 7,58
CHO 56,6 51,5 48,9 44,5 39,8
Năng lượng thô (KJ,g-1) 17,4 17,6 17,3 17,2 17,2
Tỷ lệ CHO/L 41,3:1 11,4:1 6,79:1 4,23:1 2,95:1
1 Bột cá Kiên Giang; 2 Dầu Cái Lân; 3 Dầu cá biển nhập từ Ấn Độ; 4 Premix vitamin khoáng: vitamin A (400.000 IU), vitamin D3 (80.000 IU), vitamin E (12g), vitamin K3 (2,4 g), vitamin B1 (1,6 g), vitamin B2 (3 g), vitamin B6 (1 g), niacin (1 g), vitamin B9 (0,8 g), vitamin B12 (0,00 4g), acid folic (0,032g), biotin (0,17 g), vitamin C (60g), choline (4,8g), inositol (1,5g), ethoxyquin (20,8g), Cu (10 g), FeSO4 (20 g), Mg (16,6 g), Mn (2 g), Zn (11 g) (IU/ kg; g/kg); 5 Carboxymethylcenllulose
- Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức thức ăn có các mức lipid tăng dần 1,5%; 4,5%; 7,5%; 10,5% và 13,5% với tỷ lệ CHO:L lần lượt là 38,2; 10,3; 5,97; 3,62 và 2,39. Thức ăn sử dụng có cùng hàm lượng protein 35% và cùng mức năng lượng thô 17,2 KJ/g. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ cá bố trí 30 con/bể, khối lượng cá thí nghiệm dao động từ 6,80 đến 6,85 g/con. Thời gian thí nghiệm 8 tuần.
Các chỉ tiêu cần xác định: tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng, hệ số thức ăn, hiệu quả sử dụng protein, lipid, chỉ số protein tích lũy, chỉ số lipid tích lũy và thành phần hóa học của thức ăn và của cá.
43
Hình 3.7: Hệ thống bể và cá thí nghiệm 4 Thí nghiệm 5: Xác định tỷ lệ dầu cá và dầu đậu nành thích hợp - Thức ăn thí nghiệm
Thức ăn thí nghiệm được phối trộn với các nguồn nguyên liệu chính như bột cá, bánh dầu nành ly trích, bột mì và hàm lượng dầu cá, dầu nành thay đổi theo tỷ lệ được thể hiện trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6: Thành phần nguyên liệu và thành phần hóa học thức ăn thí nghiệm 5
Nguyên liệu (%) 0%
DĐN
25%
DĐN
50%
DĐN
75%
DĐN
100%
DĐN
Bột cá 10 10 10 10 10
Bánh dầu nành ly trích 55,5 55,5 55,5 55,5 55,5
Bột mì 16,5 16,5 16,5 16,5 16,5
Dầu cá 6,22 4,66 3,11 1,55 0
Dầu đậu nành 0 1,55 3,11 4,66 6,22
Khoáng –Vitamin 2 2 2 2 2
Gelatin 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
CMC 8,80 8,80 8,80 8,80 8,80
Thành phần hóa học của thức ăn (% khối lượng khô)
Độ ẩm 8,10 6,64 5,56 6,52 5,23
Protein 34,4 34,5 34,8 34,6 35,3
Lipid 7,64 7,55 7,59 7,51 7,63
Tro 8,82 8,71 8,61 8,56 8,54
Xơ 5,94 5,94 5,94 5,94 5,94
CHO 49,1 49,1 49,0 49,3 48,6
Năng lượng thô (KJ,g-1) 17,4 17,3 17,2 17,3 17,3
Tỷ lệ CHO:L 6,43:1 6,50:1 6,46:1 6,56:1 6,36:1
Ghi chú: Dầu cá biển nhập từ Ấn Độ; Dầu nành: sản xuất tại Công ty TNHH Dầu Thực Vật Cái Lân;
CMC - Carboxymethylcenllulose
Thành phần acid béo của thức ăn thí nghiệm
Tỷ lệ n-6/n-3 trong thức ăn tăng dần, dao động từ 2,26–8,85 khi thay thế dầu cá bằng dầu đậu nành ở các mức thay thế tăng dần và tỷ lệ n-3/n-6 có xu hướng ngược lại (Bảng 3.7).
44
Bảng 3.7: Thành phần acid béo của thức ăn (% acid béo/ tổng acid béo) Acid béo
0%
DĐN
25%
DĐN
50%
DĐN
75%
DĐN
100%
DĐN
C14:0 4,47 6,09 3,24 0,76 0,88
C15:0 0,32 0,52
C16:0 28,0 33,6 26,4 19,0 20,0
C16:1n-9 8,72 8,20 5,09 0,86 0,73
C16:2n-7 1,04
C17:0 0,74
C18:0 6,49 8,39 8,25 9,11 9,21
C18:1n-9 18,07 21,69 17,9 20,5 21,0
C18:2n-6 22,58 25,57 30,64 43,9 42,8
C18:3n-3 2,01 2,80 4,27 4,52
C20:0 0,27 1,51 0,42
C20:5n-3 5,57 8,42 3,32 0,48 0,54
C22:6n-3 2,45 1,65 1,14
Tổng 100 100 100 100 100
PUFA 32,6 34,0 38,4 49,8 47,9
n-6 22,6 25,6 30,6 43,9 42,8
n-3 10,0 8,42 7,77 5,89 5,06
n6/n3 2,26 3,04 3,94 7,45 8,45
n3/n6 0,44 0,32 0,25 0,13 0,12
PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acid): nhóm acid béo không no chứa ≥ 18 carbon và ≥ 2 nối đôi = (1)+(2)+(3)+(4)+(5); 1: Linoleic acid (LIA),2: Linolenic acid (LOA),3: Arachidonic acid (ArA); 4:
Eicosapentaenoic acid (EPA); 5: Docosahexenoic acid (DHA) n–6 = (1)+(3); n–3 = (2)+(4)+(5)
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức thức ăn 0% DĐN, 25% DĐN, 50% DĐN, 75% DĐN và 100% DĐN. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ cá bố trí 30 con/bể, khối lượng cá thí nghiệm dao động từ 6,83±0,07g/con. Thức ăn có cùng hàm lượng protein 35%, béo 7,5% và mức năng lượng 17,2 KJ/g tương ứng với protein và năng lượng tiêu hóa là 31% và 13 KJ/g. Thời gian thí nghiệm 8 tuần. Các chỉ tiêu cần xác định: tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng, hệ số thức ăn, hiệu quả sử dụng protein, lipid, chỉ số protein tích lũy, chỉ số lipid tích lũy, thành phần hóa học của thức ăn và cá
- Chăm sóc cá, quản lý thí nghiệm: cá được cho ăn thỏa mãn nhu cầu, mỗi ngày cho ăn 2 lần (8 giờ và 16 giờ). Lượng thức ăn mà cá tiêu thụ và thừa trong mỗi bể được ghi nhận hàng ngày (lượng thức ăn thừa được siphon ra ngoài, sấy khô và cân lại khối lượng). Đồng thời trong thời gian thí nghiệm nước được thay định kỳ 3 ngày/ lần, mỗi lần thay 30% lượng nước trong bể. Nhiệt độ nước:
27,5–29,5oC; Oxy hòa tan: 4 ppm; pH:7,5–7,8; NH3+:0,01 ppm; NO2-:0,75 ppm.