1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa
1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA
HupA là một lycopodium alkaloit có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa ở Trung Quốc [54]. Các nghiên cứu cho thấy HupA có thể được tổng hợp hóa học [55, 56] nhưng hỗn hợp racemic ít có hiệu quả trong việc ức chế enzyme AChE so
với HupA tự nhiên có nguồn gốc chiết xuất từ thực vật [56]. Do đó, HupA thương mại vẫn chủ yếu được chiết xuất từ toàn bộ lá của loài Thạch tùng răng cưa, dẫn đến việc thu mua quá mức và sự suy giảm mạnh mẽ quần thể loài Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên trên khắp Trung Quốc [31].
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ít hơn 0,02% khối lượng tươi [57, 58] và 0,0047 - 0,025% khối lượng khô [59]. Hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Trung Quốc đạt từ 80,20 - 182,60 àg/g khối lượng khụ [60]. Thạch tựng răng cưa sinh trưởng ở cỏc khu rừng ẩm ướt có chứa hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với sinh trưởng ở các môi trường có độ ẩm thấp hơn. Thêm vào đó, hàm lượng HupA thay đổi đáng kể theo mùa, với hàm lượng HupA cao nhất thu được vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân. Hơn nữa, hàm lượng HupA còn mang tính đặc hiệu mô, mô lá non có chứa hàm lượng HupA cao nhất, tiếp đến là thân cây, sau đó đến lá già và thấp nhất ở rễ [17, 60]. Nghiên cứu khác về cây Thạch tùng răng cưa thu tại thành phố Yamagata,Nhật Bản đã xác định hàm lượng HupA ở loài cây này chiếm 0,5%
khối lượng tươi [33]. Như vậy, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phụ thuộc vào vùng phân bố, độ ẩm môi trường sống, thay đổi theo mùa, mang tính đặc hiệu mô, phụ thuộc vào quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [59, 60]. Việc tích luỹ HupA mang tính đặc hiệu mô cho thấy phương pháp nuôi cấy mô các loài thực vật trong chi Huperzia đóng vai trò quan trọng đối với việc sản xuất HupA [61].
Mặc dù, HupA có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa nhưng hợp chất này còn được tìm thấy ở nhiều loài khác có mối quan hệ gần gũi với loài Thạch tùng răng cưa thuộc họ Huperziaceae như loài H. selago có chứa hàm lượng HupA từ 0,04 đến 0,16% khối lượng tươi [62]. Mặc dù, một số loài trong họ Huperziaceae có chứa hàm lượng HupA cao hơn loài Thạch tùng răng cưa như loài H. carinata (Desv.
Ex Poir.) Trevis [= Phlegmariurus carinatus (Devs. Poir.) Ching] (hàm lượng HupA từ lỏ là 560 àg /g khối lượng khụ [60]), loài H. selago (L.) Bernhardi ex Schrank &
C.F.P. Martius (hàm lượng HupA là 1270 àg/g khối lượng khụ [63], loài H. carinata (chứa hàm lượng HupA là 1030 àg/g khối lượng khụ [2], loài H. elmeri (hàm lượng HupA là 1012 àg/g khối lượng khụ [61]) và loài H. aqualupiana (hàm lượng 204
àg/g khối lượng khụ [61]) nhưng ớt được quan tõm như loài Thạch tựng răng cưa vỡ những loài trên khó tìm và ngày càng khan hiếm hơn so với loài Thạch tùng răng cưa [64]. Ngoài ra, HupA còn được tìm thấy ở nhiều loài thực vật khác nhau thuộc họ Lycopodiaceae và Selaginella. Tuy nhiên, HupA chỉ được phân lập từ các loài thuộc chi Huperzia Bernhardi [2, 60].
Các loài thực vật trong họ Huperziacae sinh trưởng chậm và hàm lượng HupA được thu nhận từ nguồn tự nhiên bị hạn chế. Hàm lượng HupA rất thấp trong thực vật thô nên việc phát triển nguồn sản xuất HupA rất được quan tâm. Phương pháp nuôi cấy in vitro loài Phlegmariurus squarrosus, một thành viên của họ Huperziaceae, đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy mẫu mô được nuôi cấy in vitro đó sản sinh ra hàm lượng HupA (675,69 àg/g khối lượng khụ) cao hơn so với hàm lượng HupA được tổng hợp từ cõy trồng tự nhiờn (378,83 àg/g khối lượng khụ) và đây là một nguồn sản xuất HupA tuyệt vời [32].
Cytochrome P450 liên quan đến quá trình biến đổi oxy hoá của các hợp chất trung gian [65]. Hai mươi gen cytochrome P450 của loài Thạch tùng răng cưa mã hóa cho sinh tổng hợp lycopodium alkaloid (tập trung ở lá nhiều hơn ở rễ cây) đã được tìm thấy dựa trên việc so sánh dữ liệu trình tự 454-ESTs của Thạch tùng răng cưa và P. carinatus và phân tích Real-time PCR. Bốn chuỗi phiên mã giả định (PUT) CYP450 (Hs01891, Hs04010, Hs13557 và Hs00093) là các PUT chính tham gia vào quá trình sinh tổng hợp alkaloid lycopodium. Khoảng 115 PUT của loài Thạch tùng răng cưa và 98 PUT của loài P. carinatus liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các triterpenoid, alkaloid và flavones/ flavonoid [47].
Nghiên cứu về các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp HupA trong cây Thạch tùng răng cưa cho thấy, quá trình sinh tổng hợp các tiền chất của HupA chỉ có 3 loại enzyme tham gia là lysine decarboxylase (LDC) [66, 67], đồng amin oxidase (CAO), và polyketide polysetase type III (PKS) (Hình 1.8) [68].
Ngoài ra, HupA còn được tìm thấy trong các loài nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa như là Colletotrichum gloeosporioides ES026 với sản lượng trong quỏ trỡnh lờn men là 1 àg/g khối lượng khụ [69], gen CAO cú liờn quan đến quá trình sinh tổng hợp HupA ở chủng nấm ES026 [70], phát hiện hợp chất HupA và HupB trong dịch chiết nấm Colletotrichum gloeosporioides [71], loài
Paecilomyces tenuis YS - 13 [72] (sản lượng HupA trong quá trình lên men là 21,0 àg/l [72]), loài Penicillium sp. LDL4.4 (sản lượng HupA là 1380 àg/l (168,90 àg/g khối lượng khô)) và còn nhiều loài nấm khác nữa [25].
Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp của HupA [7].