CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa
2.2.2.1. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức giâm hom thân a. Nguyên liệu
Cây Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, kích thước đồng đều nhau, đã phân nhánh, được thu trong rừng Bidoup, Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng (DL1) và Nậm Cang, Sapa, Lào Cai (SP1) (thời vụ tháng 3/ 2015 và tháng 9/
2015).
Giá thể: phối trộn giữa đất rừng, phân chuồng hoai mục, trấu hun và phân trùn quế đảm bảo độ ẩm khoảng 85%.
b. Phương pháp
Thu và xử lý mẫu vật: Mẫu được thu vào những ngày có nắng, khô ráo và lấy vào buổi sáng từ 7 giờ đến 9 giờ. Sử dụng phương pháp so sánh hình thái: dựa vào các đặc điểm hình thái mẫu vật đã thu thập, tiến hành so sánh định loại với các mô tả theo tác giả Nông Văn Duy và cs, 2015 [124]. Đầu dưới cắt vát để tăng diện tích
tiếp xúc với đất giúp cây mau mọc rễ.
Vườn ươm được thiết kế ngay tại rừng. Sau khi chuẩn bị xong, hom thân sẽ được xử lý với IBA và NAA với các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau khi xử lí xong, hom thân được cắm ngay vào giá thể giâm [130].
Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần nhắc lại. Mỗi công thức giâm 120 hom thân/ lần nhắc lại trong bầu giâm kích thước 8 cm x 10 cm.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chiều dài hom thân (từ 4 cm đến 10 cm) đến tỉ lệ hồi xanh, ra rễ và ra lá mới.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể giâm đến tỉ lệ hồi xanh, ra rễ, ra lá mới, thí nghiệm gồm 4 công thức với các thành phần: đất rừng: phân chuồng hoai mục : trấu hun : phân trùn quế: CT1 tỷ lệ: 3:1:0:0; CT2 tỷ lệ: 3:1:1:0;
CT3 tỷ lệ: 3:1:1:1; CT4 tỷ lệ: 3:0:1:1.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng α - NAA, IBA, IAA đến sinh trưởng hom thân giâm Thạch tùng răng cưa.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng α -NAA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý (nhúng nước lã), xử lý 500 ppm, xử lý 1500 ppm, xử lý 2500 ppm và 3500 ppm.
Tất cả các công thức xử lý bằng cách nhúng sốc hom thân trong thời gian 4 - 6 giây.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng α - NAA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý (ngâm nước lã), xử lý 10 ppm; xử lý 20 ppm, xử lý 30 ppm và 40 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 5 phút.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IAA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý (ngâm nước lã), xử lý 50 ppm; xử lý 70 ppm, xử lý 90 ppm và 120 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 30 phút.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IBA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý
ngâm nước lã), xử lý 500 ppm; xử lý 1000 ppm, xử lý 2000 ppm và 3000 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 30 phút.
Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm (%); tỷ lệ ra rễ (%); tỉ lệ ra lá mới (%);
số lá mới; số rễ. Mỗi thí nghiệm được theo dõi trong 4 tháng kể từ ngày bắt đầu đưa hom thân vào giá thể [130].
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ bón phân đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa.
Hom thân Thạch tùng răng cưa được xử lý và giâm trong các điều kiện thích hợp nhất đã được nghiên cứu ở 3 thí nghiệm trên. Sau 3 tháng giâm hom thân, chúng tôi sử dụng các loại phân để bón thúc cho cây con. Thí nghiệm được thiết kế gồm 5 công thức bón phân: Đối chứng (không bón phân), phân vi sinh Sông Gianh, phân chuồng (phân bò), phân NPK 3 màu và phân xanh. Các chỉ tiêu được theo dõi:
tỉ lệ cây sống (%), đường kính thân và chiều cao cây con sau 2 tháng bón phân.
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ra ngôi cây con: ra ngôi 4 tháng sau giâm; ra ngôi 5 tháng sau giâm; ra ngôi 6 tháng sau giâm; ra ngôi 7 tháng sau giâm, ra ngôi 8 tháng sau giâm hom thân đến tỉ lệ cây con héo, chết và tỷ lệ cây con hồi xanh.
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013 và IRRISTAT version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05).
Tỉ lệ hom thân hồi xanh (%) = Số hom thân hồi xanh/ ∑ số hom thân giâm Tỉ lệ ra rễ (%) = Số hom thân ra rễ/ ∑ số hom thân giâm.
Tỉ lệ cây có lá mới = Số hom thân ra lá mới/ ∑ số hom thân giâm.
2.2.2.2. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức nuôi cấy mô a. Vật liệu
Nguyên liệu thực vật được sử dụng là thân của cây Thạch tùng răng cưa được thu thập ở Bidoup-Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng. Các mẫu thực vật được xác định theo mô tả của tác giả Nông Văn Duy và cộng sự (2015) [124].
Môi trường cơ bản MS [131]; 1/2 MS: 1/2 thành phần khoáng của môi trường MS, vitamin giữ nguyên theo môi trường MS; 1/4 MS: 1/4 thành phần
khoáng của MS, 1/2 vitamin của MS; 1/6 MS: 1/6 thành phần khoáng của MS, 1/4 vitamin của MS, môi trường WPM [132] và môi trường Gamborg B5 [133] đã được thử nghiệm. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA, IBA, kinetin và BA. Các thành phần khác: đường sucrose (20 g/l), agar (8 g/l).
Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm được đặt trong phòng nuôi ở nhiệt độ 22
± 2oC, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang trắng với cường độ ánh sáng 22,20 μmol/
m2/ s, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày.
b. Phương pháp nghiên cứu
i. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu nuôi cấy
Đoạn chồi đỉnh 2 - 3 cm của cây Thạch tùng răng cưa khỏe mạnh được chọn làm nguyên liệu cho quá trình khử trùng mẫu. Đầu tiên, mẫu được rửa dưới vòi nước sạch, lắc trong nước xà phòng pha loãng 3 - 5 phút, rửa sạch xà phòng dưới vòi nước chảy. Sau đó, mẫu được chuyển vào tủ cấy vô trùng, mẫu được làm sạch trong EtOH 70% trong 30 giây, rửa lại với nước cất 3 - 5 lần, xử lý bằng HgCl2 0,05 - 0,15% trong thời gian từ 3 đến 7 phút, rửa lại nước cất 3 - 5 lần, lắc bằng NaClO 20% trong 7 phút, rửa lại nước cất 3 - 5 lần, ngâm mẫu cấy trong nước cất 1 tiếng, cấy chuyển vào môi trường MS. Đánh giá khả năng khử trùng mẫu sau 30 ngày nuôi cấy qua các chỉ tiêu: tỉ lệ mẫu vô trùng và tỉ lệ mẫu bật chồi. Sử dụng công thức cho hiệu quả khử trùng tốt nhất ở thí nghiệm này để tiến hành khử trùng mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
ii. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy chồi đỉnh Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến tỉ lệ sống của chồi Thạch tùng răng cưa
Chồi Thạch tùng răng cưa in vitro được cấy chuyển vào các môi trường khoáng MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/6 MS, WPM, B5 có bổ sung 20 g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,7 -5,8, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để tìm ra môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của chồi Thạch tùng răng cưa với các chỉ tiêu theo dõi sau 60 ngày nuôi cấy: chiều cao chồi, đặc điểm chồi, số lá và kích thước lá.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cưa
Chồi Thạch tùng răng cưa được cấy chuyển vào môi trường khoáng thích hợp (đã xác định ở trên) có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA, kinetin nồng độ 0,1 - 1,5 mg/l. Theo dõi khả năng hình thành, phát triển của chồi sau 120 ngày nuôi cấy.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi Thạch tùng răng cưa in vitro
Các chồi in vitro có chiều dài từ 2 - 3 cm thu được từ các thí nghiệm trên, được tách riêng lẻ và cấy lên môi trường thích hợp có bổ sung riêng lẻ NAA, IBA với nồng độ từ 0,1- 1,5 mg/l để theo dõi khả năng hình thành và phát triển rễ của chồi in vitro sau 60 ngày nuôi cấy.
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 115 mẫu và lặp lại 3 lần.
iii. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô sẹo Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo
Môi trường
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Vitamin Axit amin
IBA Kinetin Piridoxine Glutamin
MS 0,01 0,30 2 -
ẵ MS 0,01 0,30 2 -
ẳ MS 0,01 0,30 2 -
MS - - 2 -
ẵ MS - - 2 -
ẳ MS - - 2 -
MS 0,01 0,30 2 3
ẵ MS 0,01 0,30 2 3
ẳ MS 0,01 0,30 2 3
MS - - 2 3
ẵ MS - - 2 3
ẳ MS - - 2 3
MS 0,015 0,30 2 3
ẵ MS 0,015 0,30 2 3
ẳ MS 0,015 0,30 2 3
MS 0,015 0,30 - 3
ẵ MS 0,015 0,30 - 3
ẳ MS 0,015 0,30 - 3
Sử dụng đỉnh chồi (1 - 2 mm) của cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô để
tiến hành nuụi cấy tạo mụ sẹo trờn cỏc mụi trường MS khỏc nhau (MS, ẵ MS và ẳ MS) bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, vitamin và axit amin ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.3).
Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 30 mẫu và lặp lại 3 lần.
iii. Phương pháp xử lí số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013 và IRRISTAT version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05).
iv. Một số khâu cơ bản trong quy trình đưa cây trong ống nghiệm ra ngoài vườn ươm
a. Giai đoạn tái sinh rễ để tạo cây con hoàn chỉnh
Các cụm chồi được tách thành các cụm chồi nhỏ 2 - 5 chồi/ cụm và cấy chuyển sang môi trường ra rễ.
Khi cây con có chiều cao 4 - 6 cm, có 3 - 5 rễ, chiều dài rễ đạt 2 - 3 cm và rễ có màu vàng nhạt thì kết thúc nuôi cây trong ống nghiệm.
b. Giai đoạn chuẩn bị vườn ươm cây, chuẩn bị đất, làm bầu
Đất vườn ươm, làm bầu phải tơi xốp, giầu dinh dưỡng, không mang mầm mống của sâu bệnh. Sử dụng giá thể CT2 trong thí nghiệm trên gồm đất rừng : phân chuồng hoai mục : trấu hun tỉ lệ 3 : 1 : 1 làm giá thể ươm cây.
Nếu trồng trong bầu thì sử dụng túi bầu kích thước khoảng 8 x 12 cm, độ sâu hom thân giâm xuống đất 3,5 cm.
Công thức tính: khối lượng đất = (số bầu) x (thể tích bầu) x 1,3 c. Giai đoạn ra cây từ ống nghiệm
Dùng panh để lấy các cây Thạch tùng răng cưa trong ống nghiệm ra, rửa sạch bộ rễ, rửa sạch thạch bám vào rễ, không được làm thương tổn đến bộ rễ.
Cắt bỏ 1/4 – 1/3 chiều dài lá để tránh thoát hơi nước giai đoạn mới trồng, tỉa bỏ lá già, tách cây chỉ để mỗi cây 1 - 3 chồi, chú ý khi tách không làm rụng rễ, gẫy cây.
d. Giai đoạn trồng và chăm sóc cây con
Cấy cây Thạch tùng răng cưa vào luống đã chuẩn bị với mật độ 100 cây/ m2,
hoặc trồng trực tiếp vào bầu, sau khi cấy phun nước đủ ẩm cho luống cây.
Khi giâm xong, phun thuốc trừ nấm, vi khuẩn: Kasuran hoặc Kasai, sau 02 ngày phun nhắc lại.
Chế độ chăm sóc sau khi cấy: Trong 10 ngày đầu thường xuyên phun ẩm cho cây 6-8 lần/ ngày và huấn luyện ra môi trường tự nhiên bằng cách che phủ nilong luống cây, che sáng cho luống cây bằng lưới che râm với độ che sáng 80%. Sau 15 ngày bỏ dần lưới che râm để tỉ lệ che sáng 50%, giảm dần số lần tưới nước trong một ngày và tăng lượng nước tưới trong một lần. Sau 3 tháng, tháo lưới che râm, bón thúc cho cây con bằng phân chuồng (phân bò) với liều lượng 500 kg/ 1 ha.
Phân tích số liệu: các giá trị trung bình và sai số chuẩn tính toán theo phần mềm Microsoft excel 2013.
Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) = số mẫu cấy vô trùng / ∑ số mẫu cấy Tỉ lệ mẫu bật chồi (%) = Số mẫu bật chồi / ∑ số mẫu vô trùng.
Tỉ lệ chồi ra rễ = Số chồi ra rễ/ ∑ số chồi cấy.
Tỉ lệ tạo mô sẹo = Số mẫu tạo mô sẹo / ∑ số mẫu cấy.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU