CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa
3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng
Đặc tính chữa bệnh của Thạch tùng răng cưa là do các hợp chất lycopodium alkaloid có trong cây, trong đó hoạt chất chính tạo nên đặc tính chữa bệnh của Thạch tùng răng cưa là HupA. Do đó, việc xác định sự có mặt và hàm lượng của HupA trong cây là một nhiệm vụ quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa làm nguồn dược liệu. Chính vì vậy, sau khi tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đánh giá sự đa dạng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa nhằm xác định đúng cây dược liệu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xác định hoạt chất và hàm lượng HupA bằng kỹ thuật TLC và HPLC để xác định sự có mặt của HupA trong các mẫu nghiên cứu, đồng thời tìm ra mẫu cây có chứa hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.5.1. Xác định hoạt chất HupA bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.
Trước tiên, để đánh giá sơ bộ hàm lượng HupA trong 8 mẫu Thạch tùng răng cưa thu thập ở Lào Cai và Lâm Đồng, chúng tôi tiến hành phân tích toàn bộ cây (bao gồm đỉnh chồi, bào tử, lá, thân và rễ) của các mẫu nghiên cứu.
Mẫu Thạch tùng răng cưa sau khi thu về được làm khô ở 50°C rồi chiết HupA bằng các phương pháp tách chiết đã trình bày ở phần vật liệu và phương pháp.
Dịch chiết được chạy sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau cùng với chất chuẩn. Kết quả chạy thử các hệ dung môi cho thấy, phương pháp chiết với hệ dung môi chloroform - isopropanol - ethyl acetate - ammonia (4 - 1,5 - 4 - 0,1) cho khả năng phân tách của các chất trên bản TLC rõ ràng và phù hợp nhất.
Kết quả chạy sắc ký bản mỏng dịch chiết của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với hệ dung môi chloroform - isopropanol - ethyl acetate - ammonia (4 - 1,5 - 4 - 0,1) được thể hiện trên hình 3.13.
A B
Hình 3.13. Hình ảnh chạy TLC HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa. CC: chất chuẩn; A. 1 -5 : Mẫu SP1A - mẫu SP5A; B. 6 - 8: Mẫu DL1A - mẫu DL3A. Mũi tên
chỉ vị trí vạch HupA.
Kết quả chạy TLC ở hình 3.13 cho thấy đối với dịch chiết của cả 2 mẫu SP2A và SP3A đều không thấy xuất hiện vạch đốm vàng tương đương với vạch của chất chuẩn. Đối với dịch chiết của mẫu DL2A xuất hiện vạch đốm có màu vàng (Rf
= 0,62) trùng với mẫu chất chuẩn nhưng rất mờ. Trong khi đó 4 mẫu SP1A, SP5A, DL1A và DL3A xuất hiện vạch đậm hơn và tương đương với chất chuẩn (Rf = 0,62).
Nhận định sơ bộ ban đầu, các mẫu SP1A, SP4A và SP5A có hàm lượng HupA cao hơn so với các mẫu SP2A và SP3A; các mẫu DL1A và DL3A có chứa hàm lượng HupA cao hơn mẫu DL2A.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng HupA phụ thuộc vào mùa, vùng sinh sống, quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [138]. Bên cạnh đó, hàm lượng HupA còn mang tính đặc hiệu mô. Trong cây Thạch tùng răng cưa, phần đỉnh chồi có chứa hàm lượng HupA cao nhất, tiếp đến là lá và thân cây [64]. Hơn nữa, trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, phần chồi đỉnh sẽ được sử dụng cho mục đích nhân giống loài Thạch tùng răng cưa. Chính vì vậy, để tiết kiệm nguồn nguyên liệu khai thác từ tự nhiên sử dụng cho mục đích nghiên cứu, trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt chất HupA ở hai mùa khác nhau là mùa xuân
(tháng 3) và mùa thu (tháng 9) với từng bộ phận của cây là rễ, thân và lá. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở hình 3.14.
A B
Hình 3.14. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng.
A. Mẫu mùa xuân (tháng 3). B. Mẫu mùa thu (tháng 9). 1: HupA chuẩn, 2: dịch chiết từ lá, 3: dịch chiết từ thân, 4: dịch chiết từ rễ. Mũi tên chỉ vị trí vạch HupA.
Kết quả chạy sắc kí (hình 3.14) cho thấy dịch chiết từ rễ của mẫu thu tại Lâm Đồng ở cả 2 mùa là mùa thu (tháng 9) và mùa xuân (tháng 3) đều không xuất hiện vạch đốm vàng. Điều này cho thấy hàm lượng HupA ở rễ của Thạch tùng răng cưa rất ít. Đối với dịch chiết lá và thân của các mẫu thu tại Lâm Đồng ở cả 2 mùa đều thấy xuất hiện vạch đốm vàng tương đương với vạch của chất chuẩn (Rf = 0,62), trong đó dịch chiết từ lá có màu đậm hơn so với dịch chiết từ thân. Tuy nhiên, bên cạnh vạch đốm vàng tương đương với chất chuẩn, các dịch chiết thân và lá ở cả hai mùa đều còn những vệt đốm dài và một số băng vạch ở vị trí khác, điều này cho thấy dịch chiết vẫn còn lẫn tạp chất.
Đối với các mẫu Thạch tùng răng cưa mùa thu và mùa xuân thu tại Lào Cai, chúng tôi sử dụng chạy TLC đối với mẫu lá và thân. Kết quả hình 3.15 cho thấy, dịch chiết lá của các mẫu mùa thu và mùa xuân đều xuất hiện vạch đốm vàng tương đương với chất chuẩn (Rf = 0,62). Đối với dịch chiết thân thì vạch đốm vàng xuất hiện rất mờ (dịch chiết từ thân mùa thu) hoặc không xuất hiện vạch (dịch chiết thân mùa xuân), điều này cho thấy hàm lượng HupA trong dịch chiết thân ít hơn so với dịch chiết từ lá.
Hình 3.15. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai. CC:
HupA chuẩn, 1: dịch chiết từ lá mùa thu, 2: dịch chiết từ thân mùa thu, 3: dịch chiết từ thân mùa xuân, 4: dịch chiết từ lá mùa xuân. Mũi tên chỉ vị trí vạch HupA.
Qua đây, chúng tôi nhận định sơ bộ hàm lượng HupA được tổng hợp từ lá của Thạch tùng răng cưa cao hơn so với thân và rễ; đồng thời, các mẫu thu hái vào mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA cao hơn các mẫu thu hái vào mùa xuân (tháng 3). Điều này phù hợp với nhận định của Ma và cộng sự năm 2005 về hàm lượng HupA thu được cao nhất vào mùa thu [60]. Tuy nhiên, chúng tôi cần tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để đưa ra được kết luận chính xác hơn.
3.1.5.2. Xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Để khẳng định sự có mặt và hàm lượng HupA trong các mẫu nghiên cứu một cách chính xác, khoa học, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với 8 mẫu Thạch tùng răng cưa và các bộ phận (lá, thân và rễ) của cây thu hái vào mùa thu và mùa xuân ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng.
a. Phân tích tín hiệu trên hệ thống LC
Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai. (A). Chất chuẩn HupA, (B). Mẫu lá mùa thu
(tháng 9), (C). Mẫu lá mùa xuân (tháng 3).
Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng. A. Chất chuẩn HupA, B. Mẫu lá mùa xuân
(tháng 3), C. Mẫu lá mùa thu (tháng 9).
Hình 3.18. Phổ ESI - MS Positive và peak ion phân tử 243,0.
b. Dựng đường chuẩn định lượng
Đường chuẩn định lượng được tính toán xây dựng bằng phần mềm Chemstation dựa trên diện tích peak UV 310 tại thời gian lưu 11,40 - 11,70 min.
Đường chuẩn định lượng thu được có phương trình y = 5534,34x + 41,28 (y là diện tích peak UV được chọn và x là nồng độ chất chuẩn tương ứng), với hệ số tương quan R2 = 0,99992. Hệ số tương quan R2 = 0,99992 cho thấy phương trình đường chuẩn có độ tuyến tính cao.
c. Xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa thu ở Lào Cai và Lâm Đồng được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu).
Mẫu phõn tớch Hàm lượng HupA (àg/g) DL1A 90,23a ± 0,03 DL2A 80,61c ± 0,004 DL3A 85,42b ± 0,06
SP1A 76,28d ± 0,01 SP2A 65,58g ± 0,02 SP3A 59,62h ± 0,01 SP4A 71,91e ± 0,01 SP5A 69,43f ± 0,01
5% LSD 0,05
Chú ý: Trong cùng một cột, các chữ cái khác nhau, sai khác có ý nghĩa thống kê qua kiểm định LSD với P < 0,05
Kết quả bảng 3.4 cho thấy, đối với các mẫu thu tại Lâm Đồng hàm lượng HupA cao nhất thu được ở mẫu DL1A (Bidoup – Núi Bà, Đơn Dương, Lâm Đồng) với hàm lượng HupA đạt 90,23 àg/g và thấp nhất ở mẫu DL2A (Lạc Xuõn, Đơn Dương, Lõm Đồng) với hàm lượng HupA đạt 80,61 àg/g. Đối với dịch chiết ở cỏc mẫu thu tại Lào Cai, kết quả cho thấy hàm lượng HupA cao nhất (76,28 àg/g) thu được ở mẫu SP1A (Nậm Cang, Sa Pa, Lào Cai) và thấp nhất (59,62 àg/g) ở mẫu SP3A (Tả Van, Sa Pa, Lào Cai). Đồng thời, so sánh hàm lượng HupA ở các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng và Lào Cai cho thấy hàm lượng HupA ở các mẫu thu tại Lâm Đồng cao hơn so với các mẫu thu tại Lào Cai ở mức sai khác có ý nghĩa thống kê. Sự sai khác này được giải thích là do điều kiện khí hậu và lượng mưa ở hai vùng này khác nhau, trong đó, điều kiện khí hậu ở Lâm Đồng với nhiệt độ trung bình năm dao động 18 - 25°C, lượng mưa trung bình khoảng 1.750 - 3.150 mm/ năm, độ ẩm tương đối trung bình cả năm 85 - 87%, các tháng mùa mưa độ ẩm 84 - 91% [13] thuận lợi hơn cho sự phát triển của loài Thạch tùng răng cưa và sự tích lũy hàm lượng HupA, đặc biệt là trong các tháng mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 11), lượng mưa nhiều làm tăng độ ẩm của môi trường. Nhận định này phù hợp với nghiên cứu của Ma và cộng sự (2005), loài Thạch tùng răng cưa mọc ở
rừng ẩm ướt cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với phát triển trong môi trường có độ ẩm thấp [60].
Hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa đã được xác định ở nhiều nước trên thế giới. Tại Trung Quốc, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa dao động từ 80,16 đến 182,55 àg/g khối lượng khụ [60]. Tại Philippines, hàm lượng HupA được xỏc định từ loài H. elmeri (Herter) Holub đạt 608 àg/g khối lượng khô [61]. Trong nghiên cứu của Goodger và cộng sự (2008), hàm lượng HupA cao nhất được xỏc định ở loài H. carinata thu tại Australia là 1030 àg/g khối lượng khô [2]. Ở Việt Nam, Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự (2016) đã xác định được hàm lượng HupA của loài Thạch tùng răng cưa thu ở Kontum, Tây Nguyên là 181,64 àg/g khối lượng khụ [82]. Nghiờn cứu của chỳng tụi đó xỏc định được hàm lượng HupA cao nhất tại Lõm Đồng là 90,23 àg/g khối lượng khụ. Điều này cho thấy, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện sinh thái (đất, nước, khí hậu), giống, tuổi cây, bộ phận của cây và công nghệ tách chiết. Nhận định của chúng tôi phù hợp với kết luận của Ha và cộng sự (2011) về hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng phụ thuộc vào mùa, vùng sinh sống, quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [59].
Ngoài việc xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa, vấn đề tiếp theo cần nghiên cứu là thu hoạch bộ phận nào của cây và vào thời điểm nào trong năm để thu được hàm lượng HupA cao nhất. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục đánh giá hàm lượng HupA bằng phương pháp HPLC với từng bộ phận của cây và vào hai thời điểm thường thu hoạch Thạch tùng răng cưa là mùa xuân và mùa thu (tương ứng với mùa khô và mùa mưa ở Lâm Đồng). Cụ thể, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá hàm lượng HupA thu hái vào tháng 3 và tháng 9 năm 2015 ở cả hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng.
d. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ các bộ phận và thời điểm thu hái Thạch tùng răng cưa khác nhau năm 2015.
Các mẫu Thạch tùng răng cưa sau khi chạy định tính bằng sắc kí lớp mỏng ở trên tiếp tục được phân tích bằng kỹ thuật HPLC để đánh giá chính xác hàm lượng HupA có trong từng bộ phận của cây (rễ, thân và lá). Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa
Tên mẫu
Hàm lượng HupA (àg/g mẫu khụ)
Tháng 3 năm 2015 Tháng 9 năm 2015
Rễ Thân Lá Rễ Thân Lá
DL1 17,20 ± 0,01
47,70 ± 0,01
75,40 ± 0,02
18,20 ± 0,01
48,70 ± 0,01
92,50 ± 0,02 DL2 15,40 ±
0,01
42,30 ± 0,01
73,20 ± 0,02
17,30 ± 0,01
45,20 ± 0,01
83,50 ± 0,02 DL3 16,10 ±
0,01
44,70 ± 0,01
73,50 ± 0,01
17,80 ± 0,01
47,80 ± 0,01
90,20 ± 0,02 SP1 15,30 ±
0,01
39,50 ± 0,01
72,30 ± 0,01
16,80 ± 0,01
44,60 ± 0,01
78,40 ± 0,02 SP2 14,80 ±
0,01
34,70 ± 0,01
61,50 ± 0,02
15,70 ± 0,01
38,20 ± 0,01
66,10 ± 0,02 SP3 13,10 ±
0,01
35,10 ± 0,01
59,80 ± 0,02
16,10 ± 0,01
38,10 ± 0,01
62,40 ± 0,02 SP4 15,20 ±
0,01
37,30 ± 0,01
70,60 ± 0,02
16,30 ± 0,004
40,60 ± 0,01
73,50 ± 0,02 SP5 14,90 ±
0,01
35,20 ± 0,01
69,50 ± 0,01
16,60 ± 0,004
39,50 ± 0,01
70,70 ± 0,01 Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 đều có hàm lượng HupA cao hơn so với dịch chiết từ rễ, thân và lá thu hái vào tháng 3 tương ứng. Xét về hàm lượng HupA được tổng hợp từ các bộ phận khác nhau của cây (rễ, thân và lá) thì hàm lượng HupA được tổng hợp từ lá cao nhất (92,50 àg/ g khối lượng khụ). Hàm lượng HupA tớch lũy trong lỏ cõy cao nhất, tiếp theo là thân cây và thấp nhất ở rễ cây. Điều này cho thấy để thu nhận hoạt chất HupA phục vụ cho y học nên thu hoạch lá và phần thân trên của cây, nên giữ lại phần rễ cây và phần thân ở gốc cây Thạch tùng răng cưa. Việc giữ lại phần gốc thân và rễ nhằm mục đích giúp cây có thể tái sinh các bộ phận phía trên và tiếp tục phát triển. Phương pháp thu hoạch như vậy sẽ khắc phục được việc suy giảm một lượng lớn cây Thạch tùng răng cưa. Điều này rất có ý nghĩa trong việc vừa khai thác giá trị thương mại của loài Thạch tùng răng cưa vừa góp phần bảo tồn nguồn gen loài cây này trong tự nhiên.
Đối với các mẫu lá thu hái tại Lào Cai, hàm lượng HupA trong lá thu hái vào tháng 9 và tháng 3 có sự chênh nhau tương đối nhỏ. Cụ thể, hàm lượng HupA trong cỏc mẫu SP1 và SP2 ở hai thời điểm thu hỏi chờnh lệch nhau 6,10 àg/g và 4,50 àg/g khối lượng khụ (tương ứng là 78,40 àg/g; 66,10 àg/g đối với mẫu lỏ thu hỏi vào thỏng 9 và 72,30 àg/g; 61,50 àg/g đối với mẫu lỏ thu hỏi vào thỏng 3); cỏc mẫu lỏ
SP5, SP3 và SP4 có hàm lượng HupA từ mẫu lá thu hái vào tháng 9 và tháng 3 chờnh lệch nhau ớt hơn, dao động từ 1,20 àg/g đến 2,60 àg/g.
Đối với các mẫu lá thu hái tại Lâm Đồng, hàm lượng HupA thu được cao hơn so với ở Lào Cai, sự chênh lệch hàm lượng HupA thu hái vào tháng 9 và tháng 3 khá rõ ràng. Cụ thể, hàm lượng HupA cao nhất thu được từ mẫu lá DL1 vào tháng 9 là 92,50 àg/g cũn hàm lượng HupA thu được từ mẫu lỏ DL1 thu hỏi vào thỏng 3 là 75,40 àg/g. Như vậy, hàm lượng HupA trong mẫu lỏ Thạch tựng răng cưa thu hỏi vào thỏng 9 cao hơn so với mẫu thu hỏi vào thỏng 3 là 17,10 àg/g khối lượng khụ.
Sự chênh lệch về hàm lượng HupA giữa mẫu lá DL2, DL3 thu hái vào tháng 9 và thỏng 3 là 10,30 àg/g (83,50 àg/g và 73,20 àg/g tương ứng) và 16,70 àg/g khối lượng khụ (90,20 àg/g và 73,50 àg/g tương ứng).
Kết quả trên cho thấy hàm lượng HupA phụ thuộc vào mùa trong năm. Ở Lâm Đồng vào các tháng mùa mưa (đặc biệt là từ tháng 7 đến tháng 9 tương ứng với mùa thu ở Lào Cai), lượng mưa nhiều hơn và độ ẩm không khí cao hơn so với các tháng mùa khô (đặc biệt là từ tháng 1 đến tháng 3, tương ứng với mùa xuân ở Lào Cai) sẽ thúc đẩy cây Thạch tùng răng cưa tổng hợp HupA nhiều hơn. Điều đó cho thấy lượng mưa có ảnh hưởng đến sự tổng hợp và tích lũy hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ở các vùng nghiên cứu. Kết quả này phù hợp với kết luận trong nghiên cứu của Ma và cộng sự (2005) là loài Thạch tùng răng cưa mọc ở rừng ẩm ướt cho hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với phát triển trong môi trường có độ ẩm thấp; đồng thời, hàm lượng HupA thay đổi rõ rệt ở các thời điểm khác nhau trong năm, giảm dần khi bắt đầu vào mùa đông và tăng dần vào mùa hè, với hàm lượng cao nhất vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [59, 138].
Như vậy, kết quả xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp HPLC cho thấy hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thay đổi theo mùa, mùa thu (ở Lào Cai, tương ứng với mùa mưa ở Lâm Đồng) cho hàm lượng HupA cao hơn so với mùa xuân (ở Lào Cai, tương ứng với mùa khô ở Lâm Đồng); đồng thời, sự tích luỹ HupA ở các mô lá cao hơn so với thân và rễ. Khi khai thác Thạch tùng răng cưa làm dược liệu để tách chiết HupA nên thu hoạch lá và phần thân trên của cây thay vì thu hoạch toàn bộ cây. Kết quả này có ý nghĩa đối với việc lựa chọn bộ phận và thời điểm thu hái Thạch tùng răng cưa để tách chiết và thu được hợp chất HupA cao nhất,
đồng thời sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.