1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở Việt Nam
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới
Các mẫu cấy Thạch tùng răng cưa được khử trùng bằng cách sử dụng H2O2, C2H5OH, HgCl2 và các dung dịch có chứa thành phần kháng sinh cùng với các phương pháp xử lý bằng nước nóng để loại bỏ các vi sinh vật nội sinh trong cây.
Kết quả cho thấy, phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt và loại bỏ các vi sinh vật nội sinh trong thân cây là ngâm các mẫu cấy trong nước nóng (47°C) trong 1 giờ, tiếp theo là bằng dung dịch C2H5OH 70% trong 30 giây và sau đó bằng HgCl2
0,10% trong 7 phút. Phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt đối với các túi bào tử và chồi đỉnh là ngâm các mẫu cấy trong C2H5OH 70% trong 30 giây, tiếp theo là HgCl2 0,10% trong 4 phút. Sử dụng các chất khử trùng cùng với xử lý nước nóng có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy. Các túi bào tử và chồi đỉnh hầu như không chứa vi sinh vật nội sinh là các mẫu cấy tuyệt vời cho nuôi cấy mô thực vật [112].
Yang và cộng sự (2008) đã sử dụng chồi đỉnh dài khoảng 1,0 cm đến 1,5 cm của cây Thạch tùng răng cưa làm mẫu cấy. Các mẫu cấy được tiến hành khử trùng bề mặt bằng phương pháp khử trùng đơn hoặc khử trùng kép; khử trùng bên trong bằng chất kháng sinh và dung dịch malachite green để loại bỏ các vi khuẩn, nấm nội
sinh và ngoại sinh; tiếp theo chuyển sang môi trường MS, 1/2 MS và 1/4 MS để nuôi cấy. Kết quả cho thấy phương pháp khử trùng thích hợp là sử dụng dung dịch C2H5OH 70% trong 40 giây, tiếp theo là HgCl2 0,1% trong 8 phút và sau đó là H2O2
70% trong 10 phút, và tỷ lệ vô trùng đạt được là 63%. Các mẫu cấy đã khử trùng được nuôi cấy trên môi trường có chứa 0,50 mg/l malachite green, kháng sinh 100 mg/l AAS trong 4 tuần và đạt được 52% các mẫu cấy vô trùng. Môi trường thích hợp để các mẫu cấy sinh trưởng và ra rễ chứa các thành phần khoáng của môi trường 1/4 MS, các thành phần hữu cơ của môi trường 1/2 MS, 2% đường sucrose và 4,50 g/l agar [46].
Trong nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2009), thân và đỉnh chồi được sử dụng làm mẫu cấy để tạo mô sẹo. Các mẫu cấy này được nuôi trong bốn môi trường nuôi cấy: (1) 1/2 MS + 0,05 μmol/l IBA + 1,4 àmol/l KT + 2 mg/l pirydoxin; (2) MS + 0,05 àmol/l IBA + 1,4 àmol/l KT + 2 mg/l pirydoxin; (3) 1/2 MS + 2 mg/l pirydoxine; (4) MS + 2 mg/l pirydoxine. Kết quả cho thấy môi trường thích hợp để tạo ra mô sẹo là MS + 0,05 μmol/l IBA + 1,4 μmol/l KT + 2 mg/l pirydoxine. Trong quá trình nuôi cấy mô, sự nhiễm nấm rất nguy hiểm, do đó, việc khử trùng bề mặt rất quan trọng. Có hai phương pháp khử trùng bề mặt. Phương pháp thứ 1, đỉnh chồi được ngâm trong dung dịch ethanol 70% (C2H5OH) 1 phút, 5% sodium hypochlorite (NaOCl) 1 phút và 7%
hydrogen peroxide (H2O2) 10 phút. Phương pháp thứ hai là ngâm trong HgCl2 trong 3 phút. Kết quả cho thấy, phương pháp thích hợp nhất để khử trùng bề mặt các mẫu cấy là phương pháp thứ hai [113].
Nghiên cứu nuôi cấy in vitro thể bào tử và phôi của loài Huperzia cùng với phân tích lý hóa để xác định hàm lượng HupA đã được thực hiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mẫu cấy sinh trưởng mạnh nhất ở môi trường 1/2 MS. Sau 3 tháng, các tế bào mô sẹo phát triển từ mô phân sinh đỉnh nuôi cấy chuyển thành phôi sinh dưỡng (phôi soma) [64].
Nuôi cấy mô 11 loài thực vật thuộc chi Huperzia đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy 11 loài trong chi Huperzia đã được nuôi cấy in vitro thành công [80].
Nghiờn cứu nuụi cấy mụ loài H. selago cho thấy mụi trường ẵ MS thớch hợp cho quá trình hình thành mô sẹo và phát triển thành cây của loài H. selago [64].
Năm 2015, Ma và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phương pháp khử trùng
bề mặt và khử trùng vi khuẩn nội sinh trong chồi đỉnh của cây Thạch tùng răng cưa.
Kết quả cho thấy sau khi khử trùng bề mặt, khử trùng kết hợp 0,50 mg/l malachite green với 100 mg/l AAS có thể đạt được hiệu quả tốt trong việc khử trùng mẫu cấy.
Sau khi khử trùng, các mẫu cấy vẫn chứa một loại nấm nội sinh, nhưng có thể nuôi cấy cộng sinh với nấm nội sinh này. Các tác giả đã thu nhận được chồi của loài Thạch tùng răng cưa, những chồi này dễ dàng phân chia từ thân, có tốc độ ra rễ cao.
Tốc độ ra rễ đạt 90% sau 30 ngày nuôi cấy [114].
Xu và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến đặc điểm hình thái tế bào, DNA, sự tăng sinh khối và hàm lượng HupA trong nuôi cấy in vitro loài Thạch tùng răng cưa. Các tác giả đã chỉ ra rằng trong các môi trường nuôi cấy khác nhau gồm môi tường Sh, W và Shx thì Thạch tùng răng cưa đã biệt hóa thành dạng tản, dạng sợi nấm (Rhizomorph) và dạng rêu tương ứng. Các tế bào đơn phát triển thành các cụm và phân chia tạo thành mô. Các rễ và rễ giả đã phát triển trên bề mặt dạng sợi nấm và bề mặt tế bào dạng rêu. Sự tăng sinh khối của dạng tản là 1,79 ± 31%, của dạng sợi nấm tăng 833 ± 27% và của dạng rêu tăng 1,96 ± 52% và hàm lượng HupA tương ứng là 71,7 ± 1,54 àg/l, 20,1 ± 0,82 àg/l và 0 àg/l với sai khỏc cú ý nghĩa thống kờ (P < 0,01%).
Dạng tản phát triển chậm hơn so với dạng rêu nhưng hàm lượng HupA của dạng tản là cao nhất, trong khi đó dạng rêu sinh trưởng nhanh nhất nhưng không sản xuất HupA. Nghiên cứu trên cho thấy môi trường nuôi cấy khác nhau có thể tạo ra các kiểu hình khác nhau đối với cùng kiểu gen của loài Thạch tùng răng cưa, với các thay đổi về tỉ lệ sinh trưởng và hàm lượng HupA. Dạng tản là dạng tốt nhất đối với việc sản xuất HupA [115].
1.3.1.2. Nhân giống vô tính bằng giâm hom thân
Wang và cộng sự (2008) đã thiết lập và tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy đối với loài Thạch tùng răng cưa hoang dại, thông qua việc đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự tăng trưởng của cây. Thạch tùng răng cưa được trồng trong điều kiện tự nhiên, trạng thái tăng trưởng của Thạch tùng răng cưa theo các yếu tố khác nhau như: cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm tương đối (RH), mức phân bón… đã được nghiên cứu và phân tích. Kết quả cho thấy, Thạch tùng răng cưa phát triển tốt trong môi trường nhiệt độ dao động 18,9 - 26,3°C, độ ẩm tương đối trong
phạm vi 81% - 90% và cường độ ánh sáng trong khoảng từ 1330 - 3000 lx [116].
Zeng và cộng sự (2008) đã nghiên cứu điều kiện nhân giống loài Thạch tùng răng cưa trong môi trường sinh thái học và khả năng nảy mầm của chúng, đồng thời, nghiên cứu vai trò của chất điều hòa sinh trưởng (GA3) đối với sự phát triển của Thạch tùng răng cưa. Kết quả cho thấy: (1) Phương pháp nhân giống bằng giâm hoặc chiết hom thân, các cây con có thể phát triển rễ bất định; (2) Đỉnh chồi không thể xuất hiện trở lại nếu chúng đã bị cắt đi; (3) GA3 có tác động không đáng kể đến sự tăng trưởng của loài Thạch tùng răng cưa; (4) Trong 2 năm, cây phát triển từ mầm có thể dài thêm khoảng 6 cm; (5) Trong đất có chứa kiềm, hầu hết các cây sẽ khô héo; (6) Giâm hom thân, chiết hom thân và nhân giống bằng mầm là phương pháp tốt để nhân giống loài Thạch tùng răng cưa, đặc biệt là trong môi trường sống của cây [117].
Dựa trên các vườn ươm họ Huperziaceae, thí nghiệm giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa đã được Zhang và cộng sự (2009) tiến hành trong rừng sinh thái gốc. Kết quả cho thấy, môi trường thích hợp để giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa là đất rừng sinh thái. Mùa khác nhau (mùa xuân hoặc mùa thu) không ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả của thí nghiệm giâm hom thân trong môi trường sống ban đầu. Sử dụng chất điều hoà sinh trưởng IBA cho hiệu quả tốt nhất ở nồng độ 2×10-3 ppm IBA. Chỉ số giâm hom thân chồi đỉnh là tốt hơn đáng kể so với các nhóm giâm hom thân khác. Những kết quả này rất hữu ích cho nhân giống vô tính loài Thạch tùng răng cưa [118].
Qin và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phát triển phương pháp giâm hom thân đối với loài Thạch tùng răng cưa bằng hệ thống kỹ thuật NFT thông qua việc lựa chọn các mẫu cấy, so sánh các công thức hoocmon và phương pháp xử lý, lựa chọn nồng độ chất dinh dưỡng được cung cấp, chế độ nuôi cấy, cải thiện cấu trúc và chức năng của vườn ươm NFT. Kết quả cho thấy điều kiện thích hợp cho giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa là sử dụng hom thân chồi đỉnh + ngâm IBA 1000 mg/l trong 30 phút + chất dinh dưỡng vô cơ của môi trường 1/8 MS + 98 ngày nuôi cấy NFT. Tỉ lệ ra rễ đạt 98% và tỉ lệ sống đạt 93% - 98% [119].
Sử dụng các cây Thạch tùng răng có chiều cao 10 - 15 cm làm nguyên liệu và tiến hành nuôi trồng trên 4 loại giá thể là giá thể rong rêu, giá thể đất xói mòn,
giá thể hỗn hợp đất xói mòn/ đất vườn và đất cát, sau 3 tháng nuôi trồng, kết quả cho thấy một lượng lớn các cây con đã bị héo. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót của Thạch tùng răng cưa cao nhất (90%) trong giá thể rong rêu, (53,30%) trong môi trường đất xói mòn, (40%) trong giá thể đá vermiculit/ perlit, (30%) trong giá thể cát, (20%) trong giá thể đất xói mòn/ đất vườn và thấp nhất (13%) trong môi trường đất vườn thí nghiệm. Do đó, giá thể thích hợp cho nhân giống Thạch tùng răng cưa là giá thể rong rêu [16].
Quá trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thân và mầm được tiến hành tại trang trại rừng thuộc vùng Yantuozhai, Gaowangjie, huyện Guzhang, địa khu Xiangxi, tỉnh Hồ Nam, Trung Quốc. Nghiên cứu cho thấy, 3 yếu tố được nghiên cứu để xác định ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ của hom thân là chiều dài hom thân, nồng độ NAA và thời gian xử lý NAA. Kết quả cho thấy, trong môi trường đất rừng sinh thái, sử dụng hom thân có chiều dài 6 cm, ngâm 5 phút trong NAA 20 mg/l là thích hợp nhất cho việc nhân giống hom thân. Sau 60 ngày giâm, hom thân xuất hiện rễ bất định, tỷ lệ sống lên đến 90%. Sự tăng trưởng của hom thân tăng rõ rệt sau 210 ngày nuôi trồng [120].
1.3.1.3. Nhân giống bằng bào tử
Maridass và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về sự phát triển của túi bào tử, bào tử nảy mầm, giai đoạn đầu của thể giao tử và tái sinh của H. hilliana (Spring) trong điều kiện tự nhiên của vùng Kodaiyar, miền Nam Ấn Độ. Kết quả quan sát túi bào tử trưởng thành dưới kính hiển vi của H. hilliana cho thấy bào tử nảy mầm trong vòng một tháng. Sự nảy mầm của bào tử và các giai đoạn phát triển của thể giao tử được quan sát ở điều kiện tự nhiên. Giai đoạn đầu của thể giao tử tăng trưởng mạnh mẽ. Chu kì sống của H. hilliana trong điều kiện tự nhiên ngắn, trong vòng 6 tháng (từ tháng 2/ 2011 đến tháng 7/ 2011) và bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường [121].
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, bào tử của các loài thuộc chi Huperzia phải mất 2 - 5 năm để phát triển thành thể bào tử [122]. Loài Thạch tùng răng cưa phát triển chậm hơn, thường đòi hỏi 15 - 20 năm sinh trưởng từ khi bào tử nảy mầm đến lúc cây trưởng thành đạt chiều cao từ 10 - 30 cm [31, 32, 47]. Cho đến nay, thế giới chưa thiết lập được phương pháp nảy mầm bào tử ở môi trường đất
hoặc môi trường nuôi cấy vô trùng.