CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa
3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị phân tử RAPD
Sử dụng các chỉ thị phân tử để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa sẽ góp phần cung cấp dữ liệu cần thiết cho việc thu thập, phân loại và bảo tồn nguồn gen. Bên cạnh đó, thông tin về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Thạch tùng răng cưa là cơ sở cho việc chọn tạo giống. Chính vì vậy, sau khi nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Thạch tùng răng cưa, chúng tôi tiến hành đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng bằng chỉ thị RAPD. Khảo sát thực tế tại các khu vực nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy sự phân bố của Thạch tùng răng cưa chỉ tập trung ở một số khu vực gồm 5 địa điểm tại Lào Cai (Nậm Cang, Sa Pa; Bản Hồ, Sa Pa; Tả Van, Sa Pa; Lao Chải, Sa Pa và Tả Phìn, Sa Pa) và 3 địa điểm tại Lâm Đồng (Bidoup - Núi Bà, Lạc Dương; Lạc Xuân, Đơn Dương và Nam Ban, Lâm Hà).
Chính vì vậy, trong khuôn khổ đề tài và thời gian nghiên cứu, chúng tôi sử dụng 5 mẫu thu tại Lào Cai và 3 mẫu thu tại Lâm Đồng để bước đầu đánh giá sơ bộ về sự đa dạng di truyền của nguồn gen Thạch tùng răng cưa.
3.1.4.1. Kết quả chạy PCR – RAPD
Trong nghiên cứu này, các sản phẩm PCR - RAPD được phân tích bởi 16
mồi RAPD với 8 mẫu Thạch tùng răng cưa. Sản phẩm PCR-RAPD phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên được điện di trên gel agarose 1% để phân tích đa hình.
Hình 3.9. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC5 (7 băng, 4 đa hình). Chú thích: M: marker 1 kb (Fermentas); 1 - 3: Mẫu DL1
- mẫu DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 - mẫu SP5.
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC13 (3 băng, 2 đa hình). Chú thích: M: marker 1 kb (Fermentas); 1 - 3: Mẫu
DL1 – mẫu DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 – mẫu SP5.
Hình 3.11. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB13 (1 băng, 0 đa hình). Chú thích: M: marker 1 kb (Fermentas); 1 - 3: Mẫu
DL1 – mẫu DL3; 4 - 8: Mẫu SP1 – mẫu SP5.
250 bp 1000 bp 3000 bp
250 bp 1000 bp
3000 bp 1000 bp 250 bp 3000 bp
Phân tích ảnh điện di qua việc nhị phân hóa sự xuất hiện các đoạn DNA và xử lý thống kê được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 mồi RAPD
STT Mồi Tổng số phân đoạn
Số phân đoạn đa hình
Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%)
Hệ số PIC
1 OPB1 6 5 83,33 0,82
2 OPB4 8 7 87,50 0,84
3 OPB8 4 2 50 0,74
4 OPB11 8 4 50 0,86
5 OPB13 1 0 0 0
6 OPB15 6 2 33,33 0,83
7 OPB18 3 1 33,33 0,59
8 OPB20 2 2 100 0,66
9 OPC1 5 4 80 0,73
10 OPC5 7 4 57,14 0,82
11 OPC6 4 3 75 0,71
12 OPC10 2 1 50 0,53
13 OPC12 3 1 33,33 0,62
14 OPC13 3 2 66,67 0,60
15 OPC17 4 3 75 0,71
16 OPC19 4 3 75 0,72
Tổng 70 44 10,78
Trung bình
4,38 2,75 62,86 0,67
Kết quả điện di các sản phẩm RAPD-PCR cho thấy, trong số 16 mồi nghiên cứu thì 15 mồi đa hình (chiếm tỉ lệ 93,75%) và 1 mồi đơn hình (OPB13) (chiếm tỉ lệ 6,25%). Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn DNA khi so sánh giữa các mẫu với nhau trong cùng 1 mồi. Số lượng các phân đoạn được khuếch đại của mỗi mồi thay đổi từ 1 (mồi OPB13) đến 8 (mồi OPB4 và OPB11). Tổng cộng có 70 phân đoạn được khuếch đại, trung bình là 4,40 phân đoạn/ mồi. Trong đó, số phân đoạn đa hình là 44 (chiếm 62,86% tổng số phân đoạn), số phân đoạn đơn hình là 26 (chiếm 37,14%). Ngoài mồi OPB13 không có đa hình, các mồi còn lại tỷ lệ phân đoạn đa hình nằm trong khoảng từ 33,33% (3 mồi OPB15, OPB18 và OPC12) đến 100% (mồi OPB20). Hệ số đa dạng của mồi OPC10 có giá trị PIC thấp nhất (0,53) và mồi OPB11 có giá trị PIC lớn nhất (0,86), hệ số đa dạng trung bình của các mồi đạt 0,67. Qua đây có thể thấy rằng, các mồi cho đa hình ở
loài Thạch tùng răng cưa thu tại 8 địa điểm là tương đối cao, vì vậy các mồi này có ý nghĩa trong việc đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu nghiên cứu.
3.1.4.2. Mối quan hệ di truyền và đa dạng di truyền của các mẫu Thạch tùng răng cưa nghiên cứu
Dựa trên số liệu thu được từ phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 mồi RAPD, số liệu tiếp tục được xử lý bằng phần mềm NTSYSpc version 2.0 để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các mẫu, kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.12.
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa
DL1 DL2 DL3 SP1 SP2 SP3 SP4 SP5
DL1 1.0000000
DL2 0.8405797 1.0000000
DL3 0.8115942 0.9420290 1.0000000
SP1 0.5507246 0.5652174 0.5942029 1.0000000
SP2 0.5217391 0.5362319 0.5362319 0.9420290 1.0000000 SP3 0.5942029 0.5797101 0.5797101 0.8695652 0.8405797 1.0000000 SP4 0.5652174 0.5507246 0.5797101 0.8695652 0.8695652 0.9130435 1.0000000
SP5 0.6666667 0.6521739 0.6521739 0.8260870 0.7971014 0.8115942 0.8115942 1.0000000
Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa.
Bảng 3.3 cho thấy hệ số tương đồng di truyền từng cặp của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa nghiên cứu dao động khá lớn từ 0,52 đến 0,94. Trong đó, cặp mẫu DL2 (Lạc Xuân, Đơn Dương, Lâm Đồng) và DL3 (Nam Ban, Lâm Hà, Lâm Đồng), SP1 (Nậm Cang, Sa Pa, Lào Cai) và SP2 (Bản Hồ, Sa Pa, Lào Cai) có quan hệ di
truyền gần nhất với hệ số tương đồng di truyền là 0,94 (khác biệt di truyền thấp nhất 0,06). Cặp mẫu DL1 (Bidoup, Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng) và SP2 (Bản Hồ, Sa Pa, Lào Cai) có quan hệ di truyền xa nhất vì sai khác di truyền lớn nhất là 0,48 (hệ số tương đồng di truyền 0,52).
Kết quả phân tích cho thấy 8 mẫu Thạch tùng răng cưa được chia làm 2 nhóm chính: Nhóm I gồm các mẫu Thạch tùng răng cưa được thu ở Lâm Đồng (DL1, DL2, DL3) với hệ số tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,81 đến 0,94. Trong nhóm I, mẫu DL2 và DL3 có mối quan hệ di truyền rất chặt với hệ số tương đồng di truyền cao nhất 0,94 và sự sai khác về mặt di truyền rất thấp 0,06. Mức độ sai khác di truyền tại 3 khu vực tỉnh Lâm Đồng dao động từ 0,06 đến 0,19. Nhóm II, gồm 5 mẫu Thạch tùng răng cưa được thu tại Lào Cai (SP1, SP2, SP3, SP4 và SP5) với hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,80 đến 0,94. Trong nhóm II, mẫu SP1 và SP2 có hệ số tương đồng di truyền đạt 0,94 cho thấy hai mẫu này có quan hệ họ hàng rất gần nhau, có thể bắt nguồn từ một tổ tiên chung. Mẫu SP3 và SP4 có quan hệ gần về mặt di truyền với hệ số tương đồng di truyền 0,91. Mẫu SP5 có quan hệ di truyền xa nhất so với 4 mẫu còn lại được thu ở Lào Cai với hệ số tương đồng di truyền từ 0,80 đến 0,83. Mức độ sai khác di truyền tại 5 khu vực tỉnh Lào Cai dao động trong khoảng 0,06 (cặp SP1 và SP2) đến 0,20 (Cặp SP2 và SP5). Như vậy, xét về mặt địa lý, những mẫu được thu từ những vùng cùng địa giới hành chính (cùng tỉnh) thì xu hướng tương đồng về mặt di truyền cao hơn rõ rệt so với các cặp mẫu ngoài tỉnh. Kết quả phân tích bước đầu cho thấy, mức độ sai khác về mặt di truyền giữa các cặp mẫu thu ở 5 địa điểm nghiên cứu thuộc cùng tỉnh Lào Cai hoặc 3 địa điểm nghiên cứu trong cùng tỉnh Lâm Đồng là gần tương đương nhau (dao động từ khoảng 0,06 đến trên dưới 0,20), cho thấy chúng có mối quan hệ di truyền rất gần, thậm chí có thể cùng chung một xuất xứ. Sự khác biệt về mặt di truyền đều tăng lên rõ rệt khi so sánh các cặp mẫu bất kì thu ở hai tỉnh khác nhau là Lào Cai và Lâm Đồng, với mức độ sai khác về mặt di truyền dao động giữa các cặp mẫu từ 0,33 (mẫu DL1 và SP5 có hệ số tương đồng về mặt di truyền là 0,67) đến 0,48 (mẫu DL1 và SP2 có hệ số tương đồng về mặt di truyền là 0,52). Điều đó cho thấy, các mẫu Thạch tùng răng cưa thu ở 5 địa điểm nghiên cứu thuộc khu vực Sa Pa, Lào Cai và 3 địa điểm nghiên cứu thuộc khu vực tỉnh Lâm Đồng có quan hệ họ hàng khá xa nhau. Các phân tích trên cho thấy loài Thạch tùng răng cưa phân bố tại hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng ở Việt Nam có
sự đa dạng di truyền ở mức khá cao. Sự khác nhau về mặt di truyền có thể bắt nguồn từ nguồn gốc cũng như hướng tiến hóa khác nhau tạo nên mức độ đa dạng di truyền. Các mẫu Thạch tùng răng cưa ở hai khu vực địa lý có một số tiến hóa khác nhau để thích ứng với môi trường xung quanh. Với nhiều biến đổi hơn, một số cá thể trong quần thể sẽ sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường. Những cá thể đó sẽ có cơ hội sống sót cao hơn. Nhận định trên phù hợp với kết luận của Huang và cộng sự năm 2010, trong nghiên cứu các tác giả đã chỉ ra rằng một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa như sự sinh trưởng của các dòng vô tính, ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên và lai xa và sự sinh sản hữu tính bằng cách phát tán bào tử [49]. Điều này được xem như một lý do cho sự đa dạng loài.
Mặc dù xét về mặt tổng thể các mẫu thu thập ở hai tỉnh Lào Cai và Lâm Đồng, sự đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa là khá cao nhưng trong phạm vi thuộc cùng một tỉnh sự đa dạng di truyền giữa các mẫu giảm đi rõ rệt, thậm chí rất thấp (với sai khác di truyền thấp nhất là 0,06 ở các cặp mẫu SP1 và SP2, DL2 và DL3). Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy yếu tố địa lý có tương quan đến sự khác biệt về mặt di truyền. Cụ thể, các mẫu có vị trí phân bố địa lý càng gần, mức độ tương đồng có xu hướng càng lớn, tức là mức độ sai khác về mặt di truyền càng nhỏ, các mẫu đó có sự đa dạng di truyền càng thấp và ngược lại. Điều này cho thấy các quần thể có hệ số đa dạng di truyền thấp nhiều khả năng chúng có nguồn gốc chung và xuất phát từ những quần thể tự nhiên có kích thước tương đối nhỏ. Đây là một trong những điểm cần lưu ý trong công tác bảo tồn, bởi vì nếu những quần thể nhỏ như vậy bị khai thác liên tục sẽ làm mất đi hoàn toàn một số vốn gen của quần thể. Nhận định này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Ái Minh và cộng sự (2019). Về mặt địa lý, ở Việt Nam, mức độ đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa có xu hướng tăng từ Bắc vào Nam. Sự đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam là tương đối cao ở cả cấp độ quần thể và cấp độ loài, trừ quần thể Hoàng Liên. Quần thể này có hệ số đa dạng di truyền thấp và có nguy cơ tuyệt chủng cao hơn các quần thể khác ở miền Nam nếu chúng bị khai thác liên tục [22].
Từ các kết quả nghiên cứu và nhận định trên cho thấy, chúng ta cần có kế
hoạch bảo tồn và khai thác loài Thạch tùng răng cưa một cách khoa học. Tại các vùng nghiên cứu tại Lào Cai và Lâm Đồng nên có kế hoạch bảo tồn tại chỗ nhằm duy trì và khôi phục quần thể loài Thạch tùng răng cưa trong môi trường tự nhiên.
Đồng thời, với các quần thể có mối quan hệ di truyền khá xa nhau có thể sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa nhằm duy trì sự đa dạng di truyền của quần thể. Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa trong việc bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng.