CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa
2.2.1.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm thực vật học a. Phương pháp kế thừa
Thu thập các tài liệu nghiên cứu, các công trình nghiên cứu, báo cáo tài nguyên thực vật về sự phân bố, sinh học, sinh thái học và tri thức sử dụng của người dân bản địa có liên quan đến loài Thạch tùng răng cưa.
b. Phương pháp thu mẫu:
Thành phần loài được xác định nhanh ngoài thực địa về tên địa phương, tên phổ thông, tên khoa học và thu hái, mẫu có đủ thân, lá, cơ quan sinh sản để tra cứu định danh trong phòng thí nghiệm [125].
c. Phương pháp nội nghiệp:
Sử dụng phương pháp so sánh hình thái để xác định thành phần loài thực vật [18, 19, 124].
1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng
cưa
2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa
Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu
Đánh giá đa dạng di truyền Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa
Nhân giống vô tính bằng hình thức giâm hom thân
Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô
d. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái:
Mô tả hình thái (quan sát, chụp ảnh cây tại thực địa, phân tích, chụp ảnh cơ quan sinh sản, giám định tên khoa học của cây) [124].
f. Phương pháp đo kích thước:
Dùng thước Panme, thước kẹp chuyên dụng để đo đường kính, chiều dài, chiều rộng của thân cây, lá cây.
g. Phương pháp vi phẫu:
Mẫu thân và lá Thạch tùng răng cưa được tiến hành vi phẫu theo phương pháp đã được mô tả bởi Nguyễn Quang Hiệu và cộng sự (2017) [5].
2.2.1.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền a. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách từ các mẫu lá non theo phương pháp của Saghai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến [126]. DNA tổng số được tách theo các bước sau: Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng. Bổ sung 0,6 ml CTAB vào 20 mg bột đã nghiền.
Ủ các ống trong bể ổn nhiệt (65°C/ 60 phút). Bổ sung 0,6 ml dung dịch chloroform/
isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch pha trên, bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1. Để mẫu ở tủ -20°C qua đêm.
Ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút, thu tủa. Thêm 0,6 ml EtOH 70% lạnh và ly tâm 12.000 vũng/ phỳt/ 15 phỳt, thu tủa. Để khụ và hũa tan tủa bằng 100 àl TE (10 mM Tris-HCl, 1 M EDTA, pH 8,0), ủ ở 65°C/ 60 phỳt. Bổ sung 4 àl RNase (10 mg/ ml), ủ hỗn hợp ở 37°C/ 60 phút. Bổ sung hỗn hợp phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1) theo tỉ lệ 1:1, ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu dịch pha trên, bổ sung 0,5 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12.000 vòng/
phút/ 10 phút. Thu dịch pha trên, bổ sung EtOH 100% lạnh theo tỉ lệ 2 EtOH: 1 mẫu, thêm 15 μl NaCl 5M, ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70% lạnh, bổ sung TE và giữ mẫu ở - 20°C.
Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách chiết bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Gel agarose được nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver
Scientific Ltd, Mỹ). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ xác định hàm lượng và độ tinh sạch bằng quang phổ hấp phụ OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế 8452 A Hewlett Parkard. Nồng độ DNA được tính theo công thức sau:
Nồng độ DNA (àg/ àl) = OD260 x 50 x hệ số pha loóng
DNA sau khi được xác định hàm lượng và độ tinh sạch được pha loãng về nồng độ 25 ng/ àl để chuẩn bị cho cỏc thớ nghiệm tiếp theo.
b. Phương pháp PCR với các mồi RAPD
Mười sáu (16) mồi ngẫu nhiên sử dụng trong phản ứng RAPD được tổng hợp bởi hãng Operon, Mỹ (Bảng 2.2.)
Phản ứng PCR - RAPD
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên
mồi
Trình tự nucleotide
(5’-3’) STT Tên
mồi
Trình tự nucleotide (5’-3’)
1 OPB1 GTTTCGCTCC 9 OPC1 TTCGAGCCAG
2 OPB4 GGACTGGAGT 10 OPC5 GATGACCGCC
3 OPB8 GTCCACACGG 11 OPC6 GAACGGACTC
4 OPB11 GTAGACCCGT 12 OPC10 TGTCTGGGTG
5 OPB13 TTCCCCCGCT 13 OPC12 TGTCATCCCC
6 OPB15 GGAGGGTGTT 14 OPC13 AAGCCTCGTC
7 OPB18 CCACAGCAGT 15 OPC17 TTCCCCCCAG
8 OPB20 GGACCCTTAC 16 OPC19 GTTGCCAGCC
Phản ứng PCR được thực hiện theo phương pháp của Williams và cộng sự (1990) [127]. Thể tích cuối cùng là 25 μl dung dịch chứa: đệm PCR 10X (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2 và 0,001% (w/ v) gelatin), 50 ng DNA khuôn, 0,25 mM dNTPs (Thermo Scientific), 0,025 mM mồi và 1U Taq polymerase. Hỗn hợp phản ứng được khuếch đại bằng máy PTC-100 (MJ Research Inc., USA). Phản ứng được thực hiện theo chương trình 94°C ở giai đoạn khởi đầu, 35 chu kỳ lặp lại theo 3 bước chính: biến tính DNA ở 94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi 1 phút ở 37°C và kéo dài chuỗi ở 72°C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài chuỗi ở 72°C trong vòng 5 phút. Khi hoàn thành xong phản ứng PCR, các mẫu được giữ ở 4°C để phân tích. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%,
nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel.
c. Phân tích số liệu đa dạng di truyền
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng trên bản điện di ở các mẫu nghiên cứu theo DNA thang chuẩn (DNA marker). Nếu một băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA nào xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình. Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0.
Các số liệu nhị phân này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.0 để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu [128].
Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả sử dụng mồi, các nhà khoa học còn đưa ra một thông số khác là hàm lượng thông tin tính đa hình PIC (Polymorphic Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (i). Hệ số đa hình di truyền (PIC) được tính theo công thức [129]:
PIC = 1 - Σ Pi2
Pi: tần số xuất hiện của alen thứ i.
2.2.1.3. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa
Phương pháp thu mẫu: Cây Thạch tùng răng cưa có độ tuổi từ 3 - 5 tuổi, được thu hái tại rừng ở Lào Cai và Lâm Đồng. Sau đó, sấy mẫu ở 50°C cho đến khô và bảo quản ở nhiệt độ 25 - 26°C.
Cây Thạch tùng răng cưa in vitro được nuôi cấy sau thời gian 3 năm (từ năm 2016 – 2019) được sử dụng làm nguyên liệu để xác định hàm lượng HupA.
Phương pháp tách chiết HupA:
HupA được tách chiết theo phương pháp của Ma và cộng sự (2005) có cải tiến cụ thể như sau: Nghiền mẫu bằng nitrogen lỏng. Cứ 1 g bột bổ sung 30 ml HCl 0,5% (chiết qua đêm). Tiếp theo, siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Lọc hỗn hợp sau khi siêu âm bằng giấy lọc và thêm ammonia vào phần dung dịch lọc được cho đến pH 9,0. Chiết bằng chloroform 2 lần với tỉ lệ 1:1, thu pha dưới. Loại
chloroform bằng máy cô quay chân không. Hòa tan cặn với 3 ml methanol, lưu giữ ở 4°C [60].
a. Định tính hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) Phương pháp chạy sắc ký bản mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography) được thực hiện theo phương pháp của Ma và cộng sự (2005) [60]:
Pha HupA chuẩn với methanol ở nồng độ 1 mg/ 100 ml (giữ ở 4°C). Dịch chiết HupA được chạy với các hệ dung môi khác nhau như: chloroform : isopropanol : acetone : ammonia (4 : 1,5 : 4 : 0,15); chloroform : isopropanol : ethyl acetate : ammonia (4 : 1,5 : 4 : 0,1); 1-butanol : isopropanol : acetic acid (7,5 : 2: 4) hoặc 1-butanol : isopropanol : H2O (10 : 5 : 4).
Chấm 1 àl mẫu HupA chuẩn và 10 àl cỏc dung dịch chiết ở trờn lờn bản silicagel (bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254). Các mẫu chấm cách nhau 7 mm, sấy khô rồi chạy ở các hệ dung môi khác nhau. Làm khô bản silicagel bằng máy sấy, sau đó phun KMnO4 0,3% lên bản silicagel, HupA xuất hiện có màu vàng nhạt (vết đốm).
b. Xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High-Performance Liquid Chromatography) [45]:
Mẫu chất chuẩn HupA được pha trong dung môi MeOH thành nồng độ 1 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau (0,03 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,13 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml và 1 mg/ml HupA) để thiết lập đường chuẩn định lượng.
Các mẫu Thạch tùng răng cưa được cân để xác định khối lượng, sau đó được chiết trong MeOH với thể tích xác định, dịch chiết được lọc qua màng lọc trước khi bơm vào hệ thống LC/ MS. Các dung dịch chất chuẩn và mẫu phân tích đều được lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi bơm vào hệ thống LC/ MS. Lượng mẫu bơm vào 1 àl, tốc độ dũng là 0,7 ml/ phỳt, bước súng UV định lượng 310 nm. Hệ thống LC/ MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 l/ phút, áp suất đầu phun đạt 60 psi, nhiệt độ làm khô
đạt 250°C. Chế độ bắn mảnh phổ khối lựa chọn ESI ở mode postive với peak ion phân tử được lựa chọn 243,0 [M+H]+ của HupA. Pha động sử dụng hệ dung môi:
acetonitrile (ACN)/ H2O (20 mM ammonium acetate, pH=4,0) với gradient nồng độ được thiết lập như sau: Tại thời gian 0 phút, 15 phút và 20 phút thì gradient nồng độ % ACN/ % H2O được sử dụng lần lượt là 10%/ 90% và 100%/ 0%.
Tín hiệu của HupA được phát hiện dựa vào sự trùng thời gian lưu Rt giữa detector MS và số khối MS so với chất chuẩn. Đường chuẩn định lượng được xây dựng bằng phần mềm Chemostation dựa trên diện tích peak UV tại thời gian lưu.
Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích peak UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chuẩn (x).
Hàm lượng HupA trong mẫu Thạch tùng răng cưa được tính theo công thức:
CHupA(àg/ g) = (Co x Vdd x f x 1000)/ m
Trong đó: Co: Hàm lượng HupA có trong dịch chiết Co tính theo đường chuẩn (mg/ml). Vdd: Thể tích dịch chiết thu được (ml). f: hệ số pha loãng. m: khối lượng
mẫu thử (g).