1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN VÀ CHITOSAN HÒA TAN TRONG NƯỚC
1.1.2. Các phương pháp thuỷ phân cắt mạch chitosan
Tương tự các polysaccharide khác, do tồn tại các liên kết β-1,4 glycoside không bền trong mạch phân tử nên chitosan cũng có thể bị thuỷ phân cắt mạch bằng các tác nhân vật lý, hoá học và enzyme. Để điều chế LMWC và oligochitosan, 2 phương pháp hóa học và enzyme đã được nghiên cứu, ứng dụng phổ biến. Trong đó, phương pháp thủy phân bằng hóa học đang được sử dụng chủ yếu ở qui mô công nghiệp.
Phương pháp thủy phân cắt mạch chitosan bằng enzyme có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học và vật lý nhờ giảm thiểu khả năng biến đổi hóa học không có lợi và tăng hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân. Chitosan với các mức độ DD khác nhau có thể chia thành 4 loại dựa vào sự phân bố ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside trong cấu trúc của chúng, bao gồm: chitosan với những liên kết giữa 2 đơn phân N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc-GlcNAc), giữa N-acetyl-D-glucosamine và D-glucosamine (GlcNAc-GlcN), giữa D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine (GlcN-GlcNAc), và giữa 2 đơn phân D-glucosamine (GlcN-GlcN). Các kiểu liên kết này có thể bị thủy phân bởi nhiều loại enzyme khác nhau. Tuy vậy do tính đặc hiệu
của các enzyme thủy phân chitosan (có khả năng cắt đứt 4 kiểu liên kết trong mạch chitosan đã được deacetyl từng phần) phụ thuộc rất lớn đến độ DD của chitosan, tính đồng nhất của đầu khử và không khử của mạch chitosan. Chính điều này đã làm hạn chế khả năng ứng dụng ở qui mô công nghiệp của phương pháp enzyme [45], [46].
Cho đến nay một loạt các enzyme chitosanase đã công bố chủ yếu được chiết xuất từ 2 nguồn: nấm mốc và vi khuẩn. Ngoài ra các đặc tính hóa sinh của một số chitosanase từ các vi sinh vật khác cũng được tóm lược bởi Xia và cộng sự [205]. Trong số đó chitosanase chiết xuất từ Bacillus pumilus BN-262 được nhiều nhóm tác giả sử dụng trong nghiên cứu sản xuất LMWC và oligochitosan cho kết quả rất khả quan.
Chitinase cũng đã được xác nhận như một enzyme có khả năng thủy phân chitosan với độ deacetyl khác nhau do tồn tại các gốc N-acetyl-D-glucosamine trong mạch phân tử chitosan [46]. Tuy nhiên việc phân biệt khả năng thủy phân chitosan có độ deacetyl khác nhau giữa chitosanase và chitinase là không thể xác định. Hơn nữa, các chitosanase có nguồn gốc khác nhau có hoạt tính xúc tác khác nhau phụ thuộc chủ yếu vào độ DD của chitosan và chitosanase có nguồn gốc từ vi khuẩn thường có khả năng tạo ra LMWC và oligochitosan với hiệu suất cao hơn so với chitosanase từ các nguồn khác [137]. Mặc dù chitosanase từ vi khuẩn có khả năng thủy phân chitosan tốt hơn nhiều so với hầu hết các enzyme đã được nhiều tác giả nghiên cứu sử dụng để tạo ra LMWC và oligochitosan, nhưng do chi phí chiết rút chitosanase quá đắt nên khó ứng dụng vào thực tế sản xuất qui mô lớn [138], [139].
Bên cạnh chitosanase chiết xuất từ vi sinh vật, một số enzyme carbohydrase và protease thông thường khác cũng có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4 glucoside trong mạch phân tử chitosan để tạo LMWC và oligochitosan với các khối lượng phân tử khác nhau [45]. Các kết quả nghiên cứu sử dụng papain, lipase, pectinase, lysozyme, β- glycosidase và hỗn hợp của cellulase, α-amylase and protease trong thủy phân chitosan cho thấy: ngoài chitosanase việc tạo ra LMWC và oligochitosan có thể sử dụng các loại enzyme khác nhau có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4 glucoside có trong mạch phân tử chitosan. Tuy nhiên, một vài enzyme trong số các enzyme đã được thử nghiệm kể trên có hoạt tính thủy phân chitosan thấp và để tạo ra một lượng lớn LMWC và oligochitosan cần một lượng enzyme có độ tinh khiết cao đáng kể với thời gian thủy
phân kéo dài. Vì vậy, việc lựa chọn các enzyme khác nhau với điều kiện thủy phân phù hợp, giá thành thấp có thể được sử dụng thay thế chitosanase trong sản xuất chitosan hòa tan trong nước vẫn là vấn đề nan giải hiện nay [14], [163], [205].
Với phương pháp hóa học, có thể sử dụng các acid vô cơ (HCl, HNO3, H3PO4), acid hữu cơ (acid acetic) để sản xuất LMWC và oligochitosan từ chitosan. Mặc dù được áp dụng phổ biến ở qui mô công nghiệp để sản xuất LMWC và oligochitosan nhưng phương pháp này có một số nhược điểm như: tạo ra một số chất độc ảnh hưởng không tốt đến môi trường, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp và ít nhiều ảnh hưởng đến cấu trúc sản phẩm thủy phân.
Nghiên cứu sử dụng acid HCl đậm đặc thủy phân chitosan trong điều chế LMWC và oligochitosan đã được công bố đầu tiên vào 1957 [118]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy việc thủy phân chitosan để tạo ra LMWC và oligochitosan với độ DP khác nhau có thể thực hiện được bằng acid HCl (loãng hoặc đậm đặc). Tuy vậy, acid HCl không chỉ thủy phân liên kết 1-4 glucoside trong mạch phân tử chitosan mà còn cắt đứt gốc acetyl ở một mức độ nhất định phụ thuộc vào thời gian, nhiệt độ phản ứng và nồng độ HCl sử dụng. Ngoài hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp, việc điều chỉnh tốc độ phản ứng và loại sản phẩm tạo thành luôn là vấn đề khó khăn khi sử dụng phương pháp này [93], 143], [198].
Bên cạnh tác nhân HCl, một số acid khác cũng đã được nghiên cứu sử dụng để thủy phân cắt mạch chitosan như acid nitric [192], acid phosphoric [219], acid lactic [121]. Trong các nghiên cứu này một lượng lớn acid đã được sử dụng trong quá trình thủy phân. Tương tự tác nhân HCl, một lượng đáng kể monosaccharide (D- glucosamine) cũng được tạo ra trong sản phẩm thủy phân, làm giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm, gây khó khăn cho việc tinh chế sản phẩm và sản sinh một lượng lớn nước thải acid.
Ngoài các tác nhân hóa học, một số nghiên cứu cho thấy liên kết β-1,4 glucoside trong mạch phân tử chitosan có thể cắt bởi các tác nhân vật lý như sóng siêu âm [79], [134] và bức xạ tia gamma [112], [127]. Tất cả các nghiên cứu trên chỉ dừng lại ở mức độ thử nghiệm ở PTN và việc ứng dụng vào thực tế sản xuất chưa phổ biến.
Ngoài các tác nhân hóa học kể trên, hydrogen peroxide, một tác nhân oxy hóa
mạnh có khả năng phân cắt liên kết β-1,4 glycoside trong mạch cấu trúc chitosan được sự quan tâm đáng kể bởi một số tác giả [73], [119], [132], [133], [169], [184], [190], [191]. Do hydrogen peroxide không bền trong môi trường trung tính và kiềm, dễ bị phân hủy theo phản ứng toả nhiệt tạo thành nước và oxy phân tử và nên phương pháp này ít ảnh hưởng đến môi trường, có thể sử dụng trực tiếp sản phẩm cắt mạch một cách an toàn.
Cơ chế quá trình cắt mạch chitosan bằng tác nhân hydrogen peroxide tạo chitosan có mạch phân tử ngắn đã được nghiên cứu và lý giải trên cơ sở phản ứng hình thành anion hydroperoxide từ hydrogen peroxide [73], [169], [190]. Nhóm -NH2 trong mạch phân tử bị proton hoá tạo -NH3+ khi nhận H+ trong môi trường theo các phản ứng sau:
R-NH2 + H+ = R-NH3+ (1)
H2O2 = H+ + HOO- (2)
Phản ứng tổng của 2 phản ứng (1) và (2) được biểu diễn theo phương trình:
R-NH2 + H+ + H2O2 = R-NH3+ + H+ + HOO- (3)
Anion hydroperoxide rất không bền và dễ dàng bị phân hủy tạo thành gốc hydroxyl (HO*) ở trạng thái hoạt động.
HOO- → OH- + O* (4)
H2O2 + HOO- → HO* + O2*+ H2O (5)
Gốc hydroxyl là chất oxy hoá rất mạnh. Nó phản ứng với carbohydrates rất nhanh chóng. Gốc HO* lấy một nguyên tử hydro của mạch phân tử chitosan và kết hợp nó để tạo thành nước, quá trình cắt mạch chitosan diễn ra.
(GlcN)m – (GlcN)n + HO* → (GlcN)m – (GlcN*)n + H2O (6) (GlcN*)m – (GlcN)n + H2O → (GlcN)m + (GlcN)n (7)
Trong quá trình phản ứng, gốc R-NH2 ưu tiên phản ứng với H+ tạo R-NH3+ làm nồng độ H+ giảm dần và pH tăng. Ngoài ra, HOO- nhanh chóng bị phân hủy tạo hydroxyl (HO*) (có nghĩa là hydrogen peroxide liên tục bị phân giải theo phương trình 3). Những gốc trung gian này tiếp tục tham gia các phản ứng oxy hoá, mạch ngắn lại, sản phẩm chitosan với khối lượng phân tử thấp có khả năng hoà tan trong nước hình thành trong khi các nhóm amin ở vị trí C2 trong mạch phân tử chitosan được bảo vệ bởi acid [190], [191].
Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khi có mặt các ion kim loại chuyển tiếp như Fe, Cu [73], phosphotungstic acid (PTA) [119] hoặc ozone [132] sẽ thúc đẩy phản ứng tạo gốc HO* nhanh, quá trình oxy hoá cắt mạch chitosan diễn ra thuận lợi. Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ phản ứng và nồng độ hydrogen peroxide quá cao, thời gian kéo dài việc phân cắt chitosan bằng hydrogen peroxide sẽ gia tăng tỷ lệ các monosaccharides của chitosan làm giảm hoạt tính sản phẩm. Ngoài ra việc thay đổi cấu trúc chitosan như hình thành các gốc cacboxyl và loại bỏ gốc amin cũng cần xem xét khi lựa chọn điều kiện phản ứng cắt mạch bằng hydrogen peroxide [73], [132].