CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM THÁN THƯ GÂY HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT
3.3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vivo
3.3.2.2. Đánh giá khả năng kích kháng của WSC đến bệnh thán thư hại quả xoài, chuối, ớt ở điều kiện in vivo
Khả năng phòng vệ ở mô thực vật liên quan đến những biến đổi sinh hoá tạo ra khả năng ngăn cản, chống lại những biến đổi bất lợi từ bên ngoài như tiếp xúc với các
tác nhân phi sinh học (ethylene, salicylic acid, muối, ozone, các tia bức xạ, tổn thương cơ học..) hay sinh học (các tác nhân gây bệnh, oligosaccharides) [5], [59], [168]. Do vậy, việc khảo sát sự biến đổi hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase hoặc đánh giá sự thay đổi hàm lượng các hợp chất phenol trong mô vỏ quả dưới tác động của tác nhân gây nhiễm nhân tạo là cơ sở đánh giá tác dụng kích kháng ngoại bào của WSC. Kết quả biến đổi hoạt tính chitinase và β-1,3-glucanase và những thay đổi hàm lượng polyphenol tổng số được trình bày ở các hình 3.47 - 3.55.
Hình 3.47. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ chitinase trên vỏ xoài bảo quản ở 25 - 28oC
Trên đối tượng xoài, kết quả ở hình 3.47 và 3.48 cho thấy trong cùng một mốc thời gian, hoạt độ của hai enzyme này giữa các CT đều có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), ngoại trừ các cặp CT1 và CT2 ở ngày thứ 2 và CT2 và CT3 sau 4 ngày bảo quản đối với hoạt độ β-1,3-glucanase; CT2 và CT3 ở ngày thứ 4 đối với hoạt độ chitinase. Như vậy, rõ ràng khi xoài bị nhiễm C. gloeosporioides L2 hay có xử lý WSC và lây bệnh thì hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase đều cao hơn so với mẫu ĐC và biểu hiện kích kháng ngoại bào ở mô quả xoài khá rõ chỉ sau 2 ngày bảo quản. Sau 8 ngày bảo quản, hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase ở CT3 là 0,305 IU/mg protein và 17,879 IU/mg protein, trong khi đó ở ĐC và CT2 chỉ đạt tương ứng là 0,239 IU/mg protein và 13,320 IU/mg protein, 0,256 IU/mg protein và 15,945 IU/mg protein.
Hoạt độ chitinase (IU/mg protein)
Hình 3.48. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến đến hoạt độ β-1,3-glucanase trên vỏ quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC
Hình 3.49. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ chitinase trên vỏ quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC
Hoạt độ chitinase (IU/mg protein)Hoạt độ β-1,3-glucanase (IU/mg protein)
Hình 3.50. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ của β-1,3-glucanase trên vỏ quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC
Hình 3.51. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến đến hoạt độ chitinase trên vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC
Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo C. musae D1 hay xử lý WSC đến thay đổi hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase ở vỏ quả có xu hướng khác biệt trên đối tượng chuối so với trên xoài. Kết quả ở các hình 3.49 và 3.50 cho thấy: sau 2 ngày xử lý, mô vỏ quả với xâm nhiễm bệnh thông qua lây nhiễm nhân tạo hay xử lý WSC sau khi lây nhiễm đều có hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase cao hơn so với ĐC. Ở CT2 và CT3, hoạt độ chitinase có xu hướng tăng nhanh ở thời điểm 2 ngày sau xử lý và tăng chậm
Hoạt độ chitinase (IU/mg protein) Hoạt độ β-1,3-glucanase (IU/mg protein)
dần ở các thời điểm 4 và 6 ngày, và không sai khác (p < 0,05) ở thời điểm 8 ngày.
Trong khi đó, hoạt độ β-1,3-glucanase tăng lên ở tất cả thời điểm theo dõi. Tuy nhiên không sai khác hoạt độ β-1,3-glucanase giữa CT2 và CT3 ở các thời điểm sau 2 và 6 ngày xử lý. Hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase sau 8 ngày xử lý ở CT2 và CT3 là 0,275 IU/mg protein và 0,292 IU/mg protein, 16,545 IU/mg protein và 19,092 IU/mg protein, trong khi đó ở ĐC chỉ đạt tương ứng là 0,209 IU/mg protein và 11,655 IU/mg protein.
Hình 3.52. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hoạt độ β-1,3-glucanase trên vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC
Trên quả ớt, sau 2 ngày bảo quản hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase tăng lên, tuy nhiên hoạt độ của hai enzyme này giữa các CT đều không có sự sai khác (p < 0,05) (Hình 3.51 và 3.52). So với ĐC, việc lây nhiễm nhân tạo C. capsici B4 trên quả vẫn không cho thấy sai khác về hoạt độ chitinase ở thời điểm 4 ngày bảo quản và sự sai khác chỉ được quan sát thấy ở các thời điểm 6 và 8 ngày bảo quản. Trong khi đó, ở mẫu xử lý WSC (CT3) và lây bệnh không xử lý WSC (CT2) chỉ sau 8 ngày mới cho thấy khác biệt về hoạt độ chitinase ở mô vỏ quả.
Kết quả ở hình 3.52 cũng cho thấy phản ứng tự bảo vệ và biểu hiện kích kháng ngoại bào thông qua hoạt độ β-1,3-glucanase chịu ảnh hưởng của việc lây nhiễm nhân tạo và xử lý WSC trên quả ớt là khác biệt ở các công thức TN ngoại trừ các cặp CT2
Hoạt độ β-1,3-glucanase (IU/mg protein)
và CT3 ở thời điểm 4 ngày và CT1 và CT2 ở thời điểm 6 ngày. Sau 8 ngày bảo quản, hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase ở CT3 là 0,281 IU/mg protein và 14,440 IU/mg protein, trong khi đó ở CT1 và CT2 chỉ đạt tương ứng là 0,219 IU/mg protein và 7,501 IU/mg protein, 0,257 IU/mg protein và 10,768 IU/mg protein.
Hình 3.53. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả xoài bảo quản ở 25 - 28oC
Khả năng tích lũy các hợp chất polyphenol khi có sự tương tác của việc lây bệnh trên vỏ quả và xử lý WSC trên đối tượng xoài được thể hiện qua hình 3.53. Hàm lượng polyphenol tổng số có xu hướng giảm trong quá trình bảo quản và không có sai khác ở các thời điểm trong khoảng 6 ngày theo dõi giữa CT1 và CT2 (p < 0,05). Ở mẫu xử lý WSC, kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số khác biệt so với CT1 và CT2 sau 2 ngày theo dõi, có xu hướng giảm chậm trong 4 ngày đầu và giảm nhanh hơn ở 4 ngày còn lại của quá trình bảo quản. Sau 8 ngày bảo quản, hàm lượng polyphenol ở mô vỏ quả ở CT3 giảm từ 0,509 mg GAE/g FW còn 0,335 mg GAE/g FW, cao hơn so với CT1 (0,262 mg GAE/g FW). Trong khi ở CT2 hàm lượng polyphenol tổng số giảm nhiều nhất, từ 0,511 mg GAE/g FW xuống còn 0,217 mg GAE/g FW. Điều này cho thấy, khác với biến đổi hoạt tính chitinase và β-1,3-glucanase, việc tích lũy các hợp chất polyphenol ít chịu ảnh hưởng của việc xâm nhập bệnh vào bề mặt quả. Khác biệt chỉ quan sát được do sự phân giải đáng kể các hợp chất polyphenol tích lũy trong mô vỏ diễn ra khi quả đạt trạng thái chín quá mức (8 ngày).
Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g FW) protein)
Hình 3.54. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả chuối bảo quản ở 25 - 28oC
Trên chuối, hàm lượng polyphenol tổng số ở CT1 và CT2 sau khi xử lý có xu hướng giảm xuống tương tự trên xoài ở các thời điểm trong khoảng 8 ngày theo dõi.
Tuy nhiên, có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) hàm lượng polyphenol tổng số ở thời điểm 4 và 8 ngày sau khi xử lý. Ở mẫu xử lý WSC, hàm lượng polyphenol tăng tại thời điểm 2 ngày, giảm nhanh ở các ngày còn lại và cao hơn so với CT1 và CT2 trong suốt quá trình bảo quản. Sau 8 ngày bảo quản, hàm lượng polyphenol tổng số ở mô vỏ quả giảm từ 1,784 mg GAE/g FW ở CT3 còn 1,427 mg GAE/g FW, trong khi ở CT1 và CT2 giảm tương ứng từ 1,726 mg GAE/g FW xuống 1,138 mg GAE/g FW và từ 1,705 mg GAE/g FW xuống 0,975 mg GAE/g FW. Rõ ràng, việc tích lũy các hợp chất polyphenol trên chuối không chỉ ảnh hưởng đáng kể bởi các phản ứng phân giải các hợp chất polyphenol tích lũy trong mô vỏ quả ở các thời điểm khác nhau trong quá trình bảo quản mà còn biểu hiện khả năng tự bảo vệ của mô vỏ quả bởi sự sinh tổng hợp các hợp chất phenol do sự xâm nhập và phát triển bệnh trên quả gây ra (Hình 3.54).
Sự biến đổi hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả ớt khi có sự tương tác của việc lây bệnh và xử lý WSC với nồng độ 0,5% khác biệt đáng kể so với trên xoài và chuối (Hình 3.55). Hàm lượng polyphenol tổng số có xu hướng tăng nhanh trong 4 ngày đầu và giảm dần ở 4 ngày còn lại của quá trình bảo quản ở tất cả các CT thí
Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g FW) protein)
nghiệm. Việc xử lý lây bệnh trên quả (CT2) đã tạo ra khác biệt hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ so với ĐC ở các thời điểm 2 và 4 ngày đầu bảo quản. Tuy vậy không thấy sai khác ở các thời điểm 6 và 8 ngày bảo quản (p < 0,05). Ở mẫu xử lý WSC, kết quả cho thấy trong quá trình bảo quản, hàm lượng polyphenol trên vỏ cao hơn so với trên quả chỉ lây bệnh (CT2) và ĐC, ngoại trừ thời điểm 2 ngày với mẫu chỉ lây bệnh.
Sau 8 ngày bảo quản, hàm lượng polyphenol tổng số ở mô vỏ quả ở CT3 giảm từ 3,313 mg GAE/g FW ở thời điểm 4 ngày còn 2,962 mg GAE/g FW, cao hơn so với CT1 (2,638 mg GAE/g FW). Trong khi ở CT2 hàm lượng polyphenol giảm nhiều nhất, giảm từ 3,097 mg GAE/g FW (ở 4 ngày) xuống còn 2,422 mg GAE/g FW. Kết quả này cho thấy, ảnh hưởng của việc xử lý WSC tạo ra thay đổi không chỉ hoạt tính chitinase và β-1,3-glucanase mà cả việc tích lũy các hợp chất polyphenol trên vỏ quả. Đồng thời không cho thấy ảnh hưởng đáng kể của việc lây bệnh đến hàm lượng polyphenol tổng số ngay cả khi quả đạt trái chín quá mức (8 ngày).
Hình 3.55. Ảnh hưởng của lây nhiễm nhân tạo bệnh thán thư và xử lý WSC đến hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả ớt bảo quản ở 25 - 28oC
Khả năng tự bảo vệ chống lại sự xâm nhập và phát triển của nấm bệnh trên rau quả sau thu hoạch phụ thuộc rất lớn vào hệ thống cấu trúc có khả năng ngăn cản của mô vỏ (lớp cutin biểu bì, trạng thái tồn tại của hemicellulose, lignin và pectin ở thành tế bào) và phản ứng phòng vệ của tế bào bằng cách kích hoạt sinh tổng hợp các protein PRs và các
Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g FW) protein)
hợp chất liên quan đến kháng nấm ở mô tế bào khi bị nấm bệnh xâm nhiễm [60]. Các kết quả nghiên cứu trên chỉ ra rằng, trên đối tượng xoài, chuối và ớt sau thu hoạch việc xử lý WSC tương ứng với nồng độ 1% (trên xoài, chuối) và 0,5% (trên ớt) sau khi lây bệnh thán thư đặc trưng đã cho biểu hiện kích kháng rõ rệt thông qua sự thay đổi hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase và tích lũy các hợp chất phenolic trên vỏ quả. Các kết quả là khá tương đồng với khả năng kích kháng của WSC được khảo sát trên củ khoai tây [199]
và một số kết quả nghiên cứu biểu hiện kích kháng qua sự gia tăng chitinase và β-1,3- glucanase ở mô vỏ rau quả nhiễm bệnh sau thu hoạch khi xử lý bởi chitosan và các dẫn xuất trên dâu [103], [218], đào [152], táo [212], cam [84], [94], [122], [123] hay trên một số quả có bệnh thán thư điển hình như đu đủ [49], [116], xoài [128] và chuối [207]. Tương tự như ở điều kiện in vitro, một vài khác biệt về khả năng cảm ứng kích kháng trên xoài, chuối và ớt của WSC so với các đối tượng khác được xử lý bởi chitosan và sản phẩm thuỷ phân của các nghiên cứu nêu trên có thể do khác về điều kiện thực nghiệm, đặc điểm sinh hoá đối tượng quả, khối lượng phân tử, cấu trúc và trạng thái dung dịch chitosan.
Khả năng kích kháng ngoại bào của chitosan trên rau quả sau thu hoạch được Mauch và cộng sự (1984) công bố khá sớm trên đậu Hà Lan [149]. Hạt đậu được xử lý bởi dung dịch chitosan 0,1%, hoạt tính chitinases và β-1,3-glucanase trên mô vỏ sau 30 giờ tăng lên 2 - 3 lần so với ĐC. Bên cạnh đó, việc lây bệnh nhân tạo lên hạt đậu bởi bào tử nấm bệnh đặc trưng (Fusarium solani f.sp. pisi) và không đặc trưng (Fusarium solani f.sp. phaseoli) đã tăng kích hoạt β-1,3-glucanase và chitinase tương ứng đến 4 và 9 lần. Trên củ khoai tây được lây nhiễm nấm mốc sương Phytophthora infestans, xử lý WSC có MW nhỏ (5 kDa) trong khoảng nồng độ 100 - 1000 μg/mL đã kích hoạt cảm ứng sinh tổng hợp chitinase and β-glucanase trên mô củ khoai tây với hiệu lực mạnh hơn so với WCS có MW lớn (24 kDa) [199].
Trên quả dâu, khi xử lý bề mặt bằng dung dịch chitosan ở nồng độ 10 mg/L hoặc 15 mg/L không thấy biểu hiện kích kháng thông qua hoạt tính chitinase và β-1,3- glucanase trên mô vỏ quả (đã được lây bệnh bởi nấm B. cinerea hoặc R. stolonifer) và hoạt tính chitinase chỉ khác biệt trên mô vết cắt ở mẫu quả so với ĐC [103]. Tuy nhiên, nồng độ xử lý cao hơn trên bề mặt vỏ quả dâu (1% và 2%), chitosan gia tăng cảm ứng đáng kể hoạt tính chitinases và β-1,3-glucanase [218]. Fajardo và cộng sự (1998) khi
nghiên cứu khả năng kích kháng của chitosan trên cam được lây qua vết tổn thương nhân tạo với Penicillium digitatum gây bệnh mốc xanh cũng cho thấy mối tương quan giữa nồng độ chitosan xử lý và hoạt tính của chitinase và β-1,3-glucanase cũng như mức độ nhiễm bệnh ở mô vỏ quả [94]. Ngoài ra, nghiên cứu của Inkha (2009) cũng cho thấy sự xâm nhập nấm bệnh Penicillium digitatum bằng lây bệnh nhân tạo trên cam cũng làm tăng hoạt tính của chitinase và β-1,3-glucanase ở mô vỏ quả so với mẫu không lây bệnh [122]. Trong khi đó, khả năng kích hoạt hệ thống tự bảo vệ bởi oligochitosan (1,5 - 2 kDa) trên cam có lây bệnh nhân tạo với C. gloeosporioides Penz chỉ biểu hiện rõ qua hoạt tính của β-1,3-glucanase mà không tạo khác biệt về hoạt tính của chitinase trên mô vỏ quả [84].
Theo Hewajulige và cộng sự (2009), trên quả đu đủ hoạt độ chitinase và β-1,3- glucanase ở mô vỏ quả có xử lý chitosan 1% (lây bệnh thán thư do nấm C.
gloeosporioides) cao hơn khá rõ so với mẫu quả ĐC không xử lý chitosan [116]. Cũng trên đối tượng đu đủ, cảm ứng sinh tổng hợp chitinase và β-1,3-glucanase ở mô vỏ quả đã được lây nhiễm nấm C. gloeosporioides được ghi nhận khi xử lý chitosan trong khoảng nồng độ 0,5 - 2% [48]. Trên đối tượng xoài (Nam Dok Mai), sau 10 ngày xử lý với chitosan ở nồng độ 0,5 - 2%, hoạt độ chitinase và β-1,3-glucanase ở mô vỏ quả (lây nhiễm nấm bệnh thán thư C. gloeosporioides) tăng lên đáng kể so với ĐC không xử lý. Trong đó, tác dụng kích hoạt sinh tổng hợp chitinase là mạnh hơn so với β- 1,3-glucanase [128]. Trên đối tượng chuối (Cavendish, cv. BaXi), mẫu được xử lý oligochitosan nồng độ 5g/L sau khi lây bệnh nhân tạo nấm Colletotrichum musae có hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase ở vỏ quả cao hơn đáng kể so với ĐC ở các thời điểm khảo sát (3, 6, 9 và 12 ngày) [207].
Bên cạnh khả năng cảm ứng sinh tổng hợp các enzyme có hoạt tính kháng nấm trực tiếp (chitinase và β-1,3-glucanase), biểu hiện kích kháng sau thu hoạch thông qua biến đổi hàm lượng polyphenol tổng số trên vỏ quả của WSC cũng có thể được giải thích bởi sự tích luỹ các hợp chất phenolic và biến đổi hoạt tính các enzyme liên quan đã được khẳng định trên cà chua [56], [145], đào và táo [152], [212], nho [153], [170], cam [84], đu đủ [49], chuối [148] và ớt [91], [105], [106], [156] khi xử lý bởi chitosan và sản phẩm cắt mạch của chitosan.
Trên đối tượng cà chua, khi xử lý chitosan với nồng độ 1% trên vết thương nhân
tạo ở 25oC đã cho thấy hàm lượng phenolic tổng số cùng với hoạt tính polyphenoloxidase và peroxidase ở mô vỏ quả ở các ngày thứ 2 và 3 tăng cao đáng kể so với mẫu không gây tổn thương và mẫu ĐC xử lý bằng nước vô trùng. Tuy nhiên, khác biệt này là không đáng kể khi bảo quản mẫu TN ở nhiệt độ 2oC [145]. Trong khi đó, xử lý chitosan với các khối lượng phân tử khác nhau (0,5.104 - 2,9.105 g/mol) trong khoảng nồng độ 500 - 4000 mg/L bên cạnh tác dụng ức chế nấm Botrytis cinerea gây bệnh mốc xám (được lây nhiễm nhân tạo) còn cho thấy biểu hiện kích kháng thông qua việc gia tăng hàm lượng phenolic, protein tổng số và hoạt tính peroxidase nhưng làm giảm hoạt tính polyphenoloxidase trên mô vỏ quả cà chua so với mẫu quả không xử lý [56]. Trên quả đào và táo sau thu hoạch, những thay đổi hoạt tính các enzyme liên quan đến sự tích luỹ các hợp chất phenolic nhằm giải thích cho hoạt tính kháng nấm gián tiếp của chitosan và oligochitosan cũng đã được đánh giá. Theo Meng và cộng sự (2010), xử lý bằng chitosan (350 kDa) và oligochitosan (6 kDa) với nồng độ 1,5g/L trên quả đào sau khi lây nhiễm Alternaria kikuchiana, Physalospora piricola đã cảm ứng gia tăng hoạt tính peroxidase và polyphenoloxidase ở mô vỏ cao hơn so với mẫu ĐC không xử lý bảo quản ở 25oC. Khác với hoạt tính chitinase và β-1,3-glucanase, chitosan có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp peroxidase và polyphenoloxidase ở mô vỏ quả mạnh hơn so với oligochitosan với cùng nồng độ khảo sát [152]. Kết quả nghiên cứu của Yan và cộng sự (2011) cũng cho thấy táo sau khi lây nhiễm nấm Alternaria alternata gây bệnh thối nhũn được xử lý bởi dung dịch oligochitosan (khối lượng phân tử < 10 kDa) nồng độ 5 g/L có hoạt tính phenylalanine ammonia-lyase và peroxidase ở mô vỏ cao hơn so với ĐC khi bảo quản ở 0oC [212].
Trên nho, biểu hiện kích kháng không thể hiện rõ sự khác biệt về tổng số phenolic trên vỏ quả khi xử lý sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan 1% hay xử lý cận thu hoạch bằng chitosan 1g/L có hoặc không kết hợp sinh khối VK đối kháng Cryptococcus laurentii [153]. Tuy nhiên, việc xử lý chitosan trên quả nho đã làm tăng đáng kể hoạt tính phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase và làm ổn định hoạt tính polyphenoloxidase ở mô vỏ quả trong thời gian bảo quản [153], [170]. Trên cam sau thu hoạch, oligochitosan (1,5 - 2 kDa) cảm ứng gia tăng ở mô vỏ quả hàm lượng phenol tổng số, các hợp chất phenolic phức tạp như hydroxyproline-rich glycoproteins (hợp chất cấu