CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.3. Phương pháp phân lập, tuyển chọn và định danh nấm thán thư hại xoài, chuối, ớt
2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của WSC đến hoạt độ enzyme liên quan đến khả năng kích kháng ngoại bào và biến đổi polyphenol tổng số
Thí nghiệm gồm 3 CT: Không lây bệnh, không xử lý WSC (CT1 - ĐC dương);
Có lây bệnh, không xử lý WSC (CT2 - ĐC âm); Có lây bệnh, có xử lý WSC với nồng độ 1% đối với xoài, chuối và 0,5% WSC đối với ớt (CT3). Hoạt độ chitinase, β-1,3- glucanase và hàm lượng polyphenol tổng số ở mô vỏ quả được xác định 2 ngày 1 lần tính từ khi bắt đầu lây bệnh cho đến khi kết thúc TN (sau 8 ngày).
a. Phương pháp xác định hoạt độ β-1,3-glucanase và chitinase - Tách chiết dịch protein/enzyme
Mẫu quả khoẻ được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme liên quan đến khả năng kích kháng. Chitinase và β-1,3-glucanase được tách chiết ở 4oC từ mô vỏ quả tiếp giáp vết bệnh theo phương pháp của Cao và Jiang (2006) với một vài điều chỉnh [71]. Phần vỏ quả được nghiền mịn ở trong cối thạch anh với nitơ lỏng. Cân 20 mg mẫu cho vào eppendorf, đồng hoá với 400 μL dung dịch đệm Natri acetate 0,05 M, pH = 5,2. Ly tâm 14000 v/phút ở 4oC trong 15 phút thu dịch nổi trích ly enzyme, giữ ở 4oC (Phụ lục 6).
- Xác định nồng độ protein tổng số
Nồng độ protein tổng số trong mẫu được xác định dựa vào đồ thị đường chuẩn protein (Bovine Serum Albumin - BSA) với thuốc thử Braford [68] (Phụ lục 7).
- Xác định hoạt độ β-1,3-glucanase
Hoạt độ β-1,3-glucanase được xác định theo phương pháp của Abeles & Forrence [42]. Lắc đều và ủ hỗn hợp 50 μL dịch trích ly enzyme và 50 μL laminarin 0,4% (hoà tan trong đệm Natri acetate 0,05M, pH = 5,2) ở 37oC trong 30 phút. Ngừng phản ứng bằng cách thêm 400 μL thuốc thử DNS (3,5- Dinitrosalicylic acid) và ủ ở 100oC trong 10 phút. Sau khi làm lạnh, lấy 100 μL dịch phản ứng bổ sung 400 μL nước cất, votex nhẹ và đo OD ở bước sóng 540 nm. Lượng đường khử sinh ra được xác định dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose. Mẫu ĐC được vô hoạt enzyme bằng cách ủ ở 100oC trong 10 phút và làm nguội về 40oC trước khi cho cơ chất laminarin (Phụ lục 8).
Đơn vị hoạt độ β-1,3-glucanase (IU) được xác định là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa cơ chất (laminarin) thành 1 μmol glucose sau thời gian một phút ở 37oC.
IU = i.Z.kW.k *
, (μmol/mL/phút) Trong đó:
a: nồng độ glucose tính theo đồ thị đường chuẩn (μmol/mL) n: số lần pha loãng
V1: thể tích dung dịch phản ứng (μL) V2: thể tích dịch enzyme thô (μL)
t: thời gian thực hiện thuỷ phân (30 phút)
Hoạt độ riêng của β-1,3-glucanase được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ β-1,3- glucanase trên đơn vị khối lượng protein (IU/mg protein).
- Xác định hoạt độ chitinase
Hoạt độ chitinase được xác định theo phương pháp của Dai và cộng sự [81]. Lắc ủ hỗn hợp 100 μL dịch trích ly enzyme và 100 μL chitin 1% (hoà tan trong đệm Natri acetate 0,05 M, pH = 5,2) ở 500 v/phút, 37oC trong 60 phút. Ngừng phản ứng bằng cách ủ ở 100oC trong 20 phút, ly tâm 10000 v/phút lấy dịch nổi. 100 μL dịch nổi bổ sung 100 μl thuốc thử DNS, votex nhẹ và ủ ở 100oC trong 10 phút. Lấy 100 μL dịch phản ứng bổ sung 300 μL nước cất, votex nhẹ và đo OD ở bước sóng 535 nm. Lượng đường khử sinh ra được xác định dựa vào đồ thị đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine.
Mẫu ĐC được vô hoạt enzyme bằng cách ủ ở 100oC trong 10 phút và làm nguội về 40oC trước khi cho cơ chất chitin (Phụ lục 9).
Đơn vị hoạt độ chitinase (IU) được xác định là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa cơ chất (chitin) thành 1μmol N-acetyl-D-glucosamine sau thời gian một phút ở 37oC.
IU = l.;.mn.m *
, (μmol/mL/phút) Trong đó:
b: nồng độ N-acetyl-D-glucosamine tính theo đồ thị đường chuẩn (μmol/mL)
n: số lần pha loãng
V1: thể tích dung dịch phản ứng (μL) V2: thể tích dịch enzyme thô (μL)
t: thời gian thực hiện thuỷ phân (60 phút)
Hoạt độ riêng của chitinase được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ chitinase trên đơn vị khối lượng protein (IU/mg protein).
b. Xác định polyphenol tổng số
Polyphenol tổng số có trong vỏ quả được xác định theo phương pháp Folin- Cicalteau [99] với một vài điều chỉnh. Trích ly hợp chất polyphenol trong vỏ quả bằng methanol 70% ở 70oC trong 10 phút. Tiến hành ly tâm 4200 vòng/phút trong 30 phút thu dịch nổi. 50 àL dịch nổi bổ sung 250 àL thuốc thử Folin - Cicalteau 10%, sau 5 phỳt tiếp tục bổ sung 200 àL Na2CO3 7,5%. Cho phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phũng và đo mật độ quang ở bước sóng 760 nm (Phụ lục 10).
Hàm lượng polyphenol tổng số (Pol) được tính theo CT:
Pol =r.<sssp.k.q (mg GAE/g FW) Trong đó:
a: Nồng độ tương đương acid gallic của dung dịch mẫu xác định theo đường chuẩn (àg/mL)
V: thể tích dịch chiết (10 mL) d: hệ số pha loãng
m: khối lượng mẫu tươi (g)