CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM THÁN THƯ GÂY HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT
3.3.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh thán thư hại xoài, chuối, ớt của WSC ở điều kiện in vitro
3.3.1.1. Ảnh hưởng của WSC đến sự sinh trưởng của C. gloeosporioides L2, C
Kết quả xác định ĐKTN và mức độ ảnh hưởng của WSC đến sự phát triển của C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trong môi trường PDA được thể hiện thông qua bảng 3.5 - 3.7 và hình 3.23 - 3.25.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKTN của C. gloeosporioides L2 nuôi trên PDA
Nồng độ WSC
(%)
ĐKTN (cm) PIRG
(%) 10 ngày
AUDPC 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày
0 (ĐC) 1,15aE 2,69aD 4,19aC 6,45aB 8,41aA 0 869,37a 0,05 0,81bE 1,74bD 3,06bC 5,08bB 6,57bA 21,86 651,35b 0,1 0,77bE 1,24cD 1,69cC 2,69cB 4,02cA 52,18 384,89c 0,2 0cD 0dD 0,38dC 0,73dB 1,21dA 85,62 82,30d 0,4 0cC 0dC 0,21dB 0,62dA 0,69eA 91,80 56,35e
0,8 0cA 0dA 0eA 0eA 0fA 100 0f
Ghi chú: Các giá trị trung bình đường kính tản nấm (ĐKTN), đường cong tiến triển bệnh (AUDPC) theo cột có cùng chữ cái in thường và các giá trị trung bình ĐKTN theo hàng có cùng chữ cái in hoa là không sai khác ở mức ý nghĩa p < 0,05.
ĐC (0%) 0,05% 0,1%
0,2% 0,4% 0,8%
Hình 3.23. Hình ảnh nấm C. gloeosporioides L2 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung WSC ở nhiệt độ 25 - 28oC
Kết quả phân tích trình bày ở bảng 3.5 cho thấy WSC ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của nấm C. gloeosporioides L2 gây bệnh thán thư ở tất cả các nồng độ đã khảo
sát. So với ĐC, ĐKTN của các mẫu nấm được xử lý WSC đều giảm và mức độ giảm ĐKTN tỷ lệ thuận với mức độ tăng nồng độ WSC xử lý. Kết theo dõi sự phát triển của nấm cho thấy sau hơn 6 ngày nuôi cấy, nấm mốc gây bệnh thán thư mới bắt đầu phát triển ở các đĩa petri bổ sung 0,2% và 0,4% WSC. Trong khi đó, ĐKTN ở mẫu ĐC đã đạt 4,19 cm và đĩa petri bổ sung 0,8% WSC thì nấm hoàn toàn bị ức chế sinh trưởng. ĐKTN ở các thí nghiệm sử dụng WSC với nồng độ khác nhau là sai khác có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), ngoại trừ các các đĩa petri được bổ sung WSC với nồng độ 0,05% và 0,1% ở thời điểm 2 ngày và ở đĩa các petri được bổ sung WSC với nồng độ 0,2% và 0,4% sau 6 ngày và 8 ngày nuôi. Bên cạnh sự thay đổi ĐKTN, WSC cũng làm thay đổi rõ rệt hình thái tản nấm C. gloeosporioides L2. Mẫu ĐC không có bổ sung WSC tản nấm phát triển nhanh với tốc độ đều đặn, khuẩn lạc mượt, có màu nâu trắng đặc trưng. Trong khi đó, theo thời gian nuôi cấy, ở các đĩa petri bổ sung WSC tản nấm phát triển chậm hơn và có sự biến đổi về hình thái, cụ thể bề mặt tản nấm có xu hướng rắn lại, kém mượt với màu sắc tản nấm không đồng đều, ở vùng gần tâm đĩa petri tản nấm có mầu nâu sẫm hơn và teo lại tùy thuộc vào nồng độ WSC sử dụng (Hình 3.23). Sau 10 ngày nuôi cấy, ĐKTN của mẫu ĐC là 8,41 cm. Trong khi đó, mẫu bổ sung 0,4% WSC, ĐKTN chỉ là 0,69 cm, tức ĐKTN giảm hơn 10 lần so với mẫu ĐC không bổ sung WSC.
Đối với việc đánh giá mức độ tiến triển bệnh thán thư thông qua giá trị AUDPC cũng cho thấy giá trị trung bình AUDPC giảm rõ rệt khi tăng dần nồng độ WSC xử lý (p < 0,05). Cụ thể, ở mẫu ĐC, giá trị trung bình AUDPC lớn nhất và đạt 869,37. Trong khi đó, các mẫu bổ sung WSC đều có giá trị trung bình AUDPC giảm thấp hơn mẫu ĐC và mức độ giảm càng mạnh khi tăng nồng độ WSC sử dụng và giá trị trung bình AUDPC giảm thấp nhất 56,35 ở mẫu xử lý 0,4% WSC, giảm gần 15,43 lần so với giá trị AUDPC của mẫu ĐC. Kết quả này chứng tỏ chế phẩm WSC đã ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh thán thư từ đó làm chậm lại mức độ tiến triển bệnh biểu hiện thông qua làm giảm ĐKTN. Như vậy, hiệu lực ức chế sự phát triển nấm C. gloeosporioides L2 tăng theo chiều tăng nồng độ WSC sử dụng. Hiệu lực ức chế C. gloeosporioides L2 cao nhất ở nồng độ 0,8% và thấp nhất ở nồng độ 0,05% tương ứng với giá trị PIRG là 100% và 21,86%. Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và PIRG (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,8%) được xác định: y = 28,27.ln(x) + 115,78 (R2 = 0,9021). Giá
trị EC50 vàMIC90 tương ứng là 0,09% và 0,40%.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKTN của C. musae D1 nuôi trên PDA
Nồng độ WSC (%)
ĐKTN (cm) PIRG
(%)
10 ngày AUDPC 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày
0 (ĐC) 2,08aE 4,11aD 5,63aC 6,99aB 8,15aA 0 1048,50a 0,1 1,24bE 3,04bD 4,17bC 4,66bB 6,92bA 15,12 765,70b 0,2 1,07bE 2,25cD 3,62cC 4,51bB 6,19cA 23,98 672,58c 0,4 0,00cC 0,00dC 1,02dB 1,60cA 1,89dA 76,85 170,85d 0,8 0,00cB 0,00dB 0,00eB 0,21dA 0,24eA 97,04 16,09e 1,6 0,00cA 0,00dA 0,00eA 0,00dA 0,00eA 100 0e Ghi chú: - Các giá trị trung bình ĐKTN, AUDPC theo cột có cùng chữ cái in thường và các giá trị trung bình ĐKTN theo hàng có cùng chữ cái in hoa là không sai khác ở mức ý nghĩa p<0,05.
ĐC (0%) 0,05% 0,1%
0,2% 0,4% 0,8%
Hình 3.24. Hình ảnh nấm C. musae D1 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, bổ sung WSC ở nhiệt độ 25 - 28oC
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ WSC đến ĐKTN của C. capsici B4 nuôi trên PDA
Nồng độ WSC (%)
ĐKTN (cm) PIRG
(%)
10 ngày AUDPC 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày
0 (ĐC) 1,94aE 2,92aD 4,66aC 6,40aB 7,58aA 0 899,85a 0,05 1,06bE 2,60bD 4,14bC 5,70bB 7,05bA 6,96 791,86b 0,1 1,02bE 2,23cD 3,88bC 5,22cB 6,61cA 12,78 727,34c 0,2 0cD 0dD 0,83cC 1,17dB 1,78dA 76,48 138,73d
0,4 0cB 0dB 0dB 0eB 0,23eA 96,94 5,56e
0,8 0cA 0dA 0dA 0eA 0eA 100 0e
Ghi chú: - Các giá trị trung bình ĐKTN, AUDPC theo cột có cùng chữ cái in thường và các giá trị trung bình ĐKTN theo hàng có cùng chữ cái in hoa là không sai khác ở mức ý nghĩa p<0,05.
ĐC (0%) 0,05% 0,1%
0,2% 0,4% 0,8%
Hình 3.25. Hình ảnh nấm C. capsici B4 sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA bổ sung WSC ở nhiệt độ 25 - 28oC
Ảnh hưởng của WSC đến sự phát triển của tản nấm C. musae D1 yếu hơn so với tác động của WSC tới sự phát triển của tản nấm C. gloeosporioides L2. Sau hơn 6
ngày nuôi, nấm C. musae D1 mới bắt đầu phát triển ở các mẫu nuôi bổ sung 0,4%
WSC, cùng thời gian này, ĐKTN ở mẫu ĐC đã đạt 5,63 cm và nấm chỉ bị ức chế sinh trưởng hoàn toàn khi nồng độ WSC sử dụng là 1,6%. Tuy vậy, ở các nồng độ WSC sử dụng 0,4% và 0,8% lại không có sự sai khác (p < 0,05) về ĐKTN ở các thời điểm sau 8 và 10 ngày nuôi cấy. Sau 10 ngày nuôi cấy, ĐKTN của mẫu đối chứng là 8,15 cm, trong khi đó ĐKTN của mẫu xử lý WSC 0,8% chỉ là 0,24 cm, giảm hơn 33 lần so với ĐKTN của mẫu ĐC (Bảng 3.6). Từ các phân tích ở trên cho thấy WSC cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của nấm thán thư C. musae D1 thông qua ảnh hưởng đến hình thái tản nấm. Cụ thể, ở các mẫu xử lý WSC, tản nấm C. musae D1 nuôi trên PDA có màu nhạt và xốp hơn so với mẫu ĐC (Hình 3.24). Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và PIRG (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,1 - 1,6%) được xác định: y = 35,03.ln(x) + 94,70 (R2 = 0,9024). Giá trị EC50 vàMIC90 tương ứng là 0,28 và 0,88%.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nồng độ WSC đến sự sinh trưởng phát triển của C.
capsici B4 được trình bày ở bảng 3.7 cho thấy ở tất cả các nồng độ đã khảo sát nấm gây bệnh thán thư C. capsici B4 luôn nhạy cảm hơn với tác động của WSC so với C.
gloeosporioides L2 và C. musae D1. Cụ thể, ở nồng độ 0,2%, sau 6 ngày nấm bắt đầu phát triển, ở nồng độ WSC 0,4% phải sau 10 ngày nuôi cấy nấm mới xuất hiện và ở nồng độ WSC bổ sung là 0,8% WSC thì nấm bị ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng phát triển. Trong khi đó ở mẫu ĐC, ĐKTN C. capsici B4 sau 10 ngày nuôi đã đạt 7,58 cm.
Kết quả phân tích thống kê còn cho thấy, ở thời điểm 10 ngày nuôi trên môi trường PDA bổ sung WSC không có sai khác về ĐKTN khi nồng độ WSC bổ sung là 0,4%
và 0,8% (p < 0,05). Kết quả quan sát hình thái còn cho thấy WSC khi bổ sung vào môi trường nuôi ở các nồng độ 0,2% và 0,4% đã làm thay đổi hình thái tản nấm C. capsici B4 về màu sắc và đặc điểm sợi nấm (Hình 3.25). Tương quan giữa nồng độ WSC (x) và PIRG (y) trong khoảng nồng độ khảo sát (0,05 - 0,8%) được xác định: y = 399,75x2 + 465,26x - 17,44 (R2 = 0,9393). Giá trị EC50 vàMIC90 tương ứng là 0,16 và 0,45%.
Hoạt tính kháng nấm của chitosan và các dẫn suất của nó trong điều kiện in vitro trên môi trường rắn (PDA) đã được một số nhà khoa học nghiên cứu trên một số chủng nấm gây bệnh phân lập từ đất, cây trồng [50], [117], [185] và trên đối tượng nấm bệnh rau quả sau thu hoạch [102], [103]. Kết quả nghiên cứu của Ghaouth và cộng sự (1992)
cho thấy chitosan có tác dụng ức chế đáng kể sự phát triển của nấm Botrytis cinerea và Rhizopus stolonifer gây bệnh mốc xám và thối trái trên quả dâu (ở các nồng độ khảo sát 0,75; 1,5; 3; 6 mg/mL) với hiệu lực đạt đến 71,5% và 95,5% tương ứng với R. stolonifer và B. cinerea ở nồng độ chitosan 6 mg/ml sau 7 ngày nuôi ở 24oC [104]. Hiệu lực ức chế hơn 50% khi sử dụng chitosan để ức chế nấm Fusarium oxysporum f. sp. radicis- lycopersici gây bệnh thối nhũn ở cà chua với nồng độ 1 mg/ml và đạt đến 98,7% và 99,9% tương ứng nồng độ chitosan sử dụng là 3mg/ml và 6 mg/mL [65]. Hoạt tính kháng nấm B. cinerea của chitosan trên cà chua sau thu hoạch cũng đã được tái khẳng định với hiệu lực ức chế 100% phát triển tản nấm ở nồng độ chitosan 0,5% ở 25oC [64], [145] và khả năng kháng nấm R. stolonifer của chitosan có khối lượng phân tử khác nhau cũng được Hernández-Lauzardo công bố [114].
Tương tự như trên, Meng và cộng sự (2010) cho rằng chitosan và dẫn xuất oligochitosan đều ức chế đáng kể đến sự phát triển của nấm Alternaria kikuchiana và Physalospora piricola gây bệnh trên quả lê khi nuôi chúng trên môi trường PDA. Kết quả nghiên cứu còn cho thấy hiệu lực ức chế phát triển A. kikuchiana và P. piricola phụ thuộc vào loại và nồng độ chitosan. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, cả chitosan và oligochitosan với nồng độ 5 g/L (0,5%) đều ức chế hoàn toàn 2 loại nấm này. Hiệu lực ức chế 50% (EC50) của chitosan và oligochitosan đến sự phát triển của sợi nấm A. kikuchiana là 1,72 g/L (0,172%) và 1,46 g/L (0,146%), trong khi đối với sợi nấm là P. piricola tương ứng là 0,4 g/L (0,04%) và 0,35 g/L (0,035%). Kết quả này cho thấy oligochitosan có khả năng ức chế phát triển nấm bệnh tốt hơn chitosan, đặc biệt là với nấm P. piricola [153]. Năm 2011, khi nghiên cứu ảnh hưởng của oligochitosan (trong khoảng nồng độ 0,01 - 2%) đến bệnh thối Alternaria do nấm Alternaria alternate hại táo sau thu hoạch, Yan và cộng sự nhận thấy sau 6 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 27oC, sự tăng trưởng của sợi nấm A. alternate bị ức chế đến 70%, 77%, 92%, 95% và 98% tương ứng với các nồng độ oligochitosan sử dụng là 0,2%; 0,5%; 1%; 1,5% và 2%. Giá trị IC50 sau 4 và 6 ngày nuôi cấy lần lượt là 0,078% và 0,169% [212].
Yang và cộng sự (2012) đã tiến hành so sánh khả năng ức chế sự phát triển của nấm Monilinia fructicola gây bệnh thối nâu trên quả lê giữa chitosan và oligochitosan với nồng độ sử dụng trong điều kiện in vitro là 0,1; 0,2; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2; 5 g/L
và nhận thấy oligochitosan có khả năng ức chế sự tăng trưởng của nấm bệnh M.
fructicola tốt hơn chitosan. Hiệu lực ức chế IC50 của chitosan và oligochitosan với nồng độ tương ứng là 0,7 g/L và 0,5 g/L [214]. Ngoài ra việc bổ sung chitosan trong môi trường PDA trong khoảng nồng độ 0,6 - 4,5 g/L cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế phát triển nấm A. parasiticus và hạn chế sản sinh độc tố aflatoxin B1 trong môi trường [53].
Hoạt tính kháng nấm gây bệnh thán thư trên một số rau quả sau thu hoạch ở điều kiện in vitro trên môi trường PDA bổ sung chitosan cũng được công bố. Trên nấm gây bệnh thán thư trên xoài, chitosan với các nồng độ 0,5%, 1%, 1,5% và 2% bổ sung vào môi trường PDA có khả năng ức chế sự phát triển của nấm C. gloeosporioides và làm cho ĐKTN giảm chỉ còn 59,67 mm và 34 mm tương ứng ở nồng độ chitosan sử dụng là 0,5% và 2%, trong khi đó ở mẫu ĐC sau 9 ngày nuôi ở 25oC, khuẩn lạc đã tràn đĩa đường kính 9cm [128]. Hiệu quả ức chế sự phát triển nấm C. gloeosporioides trên xoài của chitosan cũng được Abd-Alla và Haggag (2011) công bố với hiệu lực ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm C. gloeosporioides ở nồng độ chitosan sử dụng 0,8% sau 10 ngày nuôi cấy ở 22 - 25oC [41]. Trong môi trường PDA sau 7 ngày nuôi ở 28 ± 2oC, chitosan với nồng độ 1,5% và 2% ức chế nấm C. gloeosporioides gây bệnh thán thư ở quả đu đủ đến 90 - 100% [48]. Trong một nghiên cứu khác, Maqbool và cộng sự (2010) khi khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến sự sinh trưởng của nấm C. musae gây bệnh thán thư trên chuối nhận thấy sự phát triển của loại nấm này trên môi trường PDA (25oC) bị ức chế hoàn toàn bởi chitosan ở nồng độ 1% và 1,5% trong suốt 7 ngày nuôi cấy [147]. Cũng trên đối tượng C. musae, kết quả nghiên cứu của Jinasena cho thấy hiệu lực ức chế của chitosan cắt mạch bằng bức xạ đối với nấm C. musae trong môi trường PDA cao hơn hẳn chitosan không được cắt mạch, cụ thể chitosan được cắt mạch bằng chiếu xạ với liều chiếu xạ 5 kGy có khả năng ức chế hoàn toàn sự sinh trưởng phát triển của loại nấm này với nồng độ 0,3%, trong khi đó chitosan phải sử dụng tới nồng độ là 0,75% [127]. Xiangchun và cộng sự (2012) cho thấy oligochitosan với nồng độ 1, 2, 4 và 8 g/L có khả năng ức chế sự sinh trưởng của nấm C. musae và nồng độ oligochitosan sử dụng càng lớn thì hiệu lực ức chế càng tăng. Cụ thể, oligochitosan với nồng độ 4 g/L và 8 g/L ức chế tương ứng đến 65,4% và 71,6% ĐKTN so với mẫu ĐC
[207]. Trên ớt sau thu hoạch, việc bổ sung chitosan MW thấp vào môi trường nuôi cấy (PDA) cũng gây ức chế rõ rệt sự phát triển của nấm C. capsici gây bệnh thán thư trên ớt quả và ở nồng độ chitosan sử dụng 1,5% và 2% làm ĐKTN giảm hơn 70% so với mẫu ĐC sau 7 ngày nuôi cấy ở 25oC [91].
Từ các nghiên cứu trên cho thấy chitosan và chitosan khối lượng phân tử thấp đều có tác dụng ức chế đáng kể các loại nấm bệnh khác nhau với ngưỡng nồng độ ức chế hoàn toàn phát triển sợi nấm trong môi trường PDA trong khoảng nồng độ 0,5 - 2%. Đồng thời, chitosan MW thấp và sản phẩm cắt mạch oligochitosan có hiệu quả ức chế sự phát triển của nấm bệnh tốt hơn so với chitosan MW lớn. Như vậy, kết quả kháng nấm C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4 trong môi trường PDA của luận án bằng chế phẩm WSC thu được là phù hợp với các NC khả năng kháng nấm của chitosan và sản phẩm cắt mạch của nó đã được công bố kể trên.
Tóm lại, ở điều kiện in vitro trong môi trường PDA cho thấy WSC đã ức chế rõ rệt đến sự phát triển của C. gloeosporioides L2, C. musae D1 và C. capsici B4. Trong khoảng nồng độ từ 0,05 - 0,8% (đối với nấm C. gloeosporioides L2 và C. capsici B4) và 0,1 - 1,6%
(đối với nấm C. musae D1), WSC không chỉ ức chế sự sinh trưởng của nấm gây bệnh thán thư thể hiện qua việc làm giảm ĐKTN mà còn gây nên những biến đổi về hình thái khuẩn lạc nấm với hiệu lực ức chế tăng khi tăng nồng độ WSC xử lý.
3.3.1.2. Ảnh hưởng của WSC đến sinh khối sợi nấm C. gloeosporioides L2, C.