CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH NẤM THÁN THƯ GÂY HẠI XOÀI, CHUỐI, ỚT
3.2.1. Phân lập nấm gây bệnh thán thư trên xoài, chuối, ớt
Tiến hành thu thập mẫu trái cây có bệnh thán thư và phân lập bệnh thán thư từ mẫu bệnh của hai giống xoài (xoài cát Hòa Lộc và xoài cát Chu), hai giống chuối (chuối tiêu hồng Cavendish, chuối mốc) và một giống ớt (ớt sừng trâu). Sau 7 ngày ủ các mẫu có vết bệnh ở 25 - 28oC, luận án đã phân lập và bước đầu làm thuần thu được 16 chủng nấm bệnh với hình thái khác nhau bao gồm: 6 chủng từ xoài (C1, C2 từ xoài cát Chu; L1, L2, L3, L4 từ xoài cát Hòa Lộc), 5 chủng từ chuối (D1, D2, D3 từ chuối tiêu hồng Cavendish; T1, T2 chủng từ chuối mốc) và 4 chủng từ ớt sừng trâu (B1, B2, B3, B4). Các chủng nấm trên được giám định qua quan sát đại thể (hình thái, màu sắc khuẩn lạc) và vi thể (đặc điểm bào tử phân sinh) trên môi trường PDA. Kết quả giám định được trình bày ở các hình 3.9 - 3.11.
Kết quả quan sát hình thái 16 chủng phân lập được cho thấy các chủng C2, L1, L2 có mức tương đồng cao về hình thái, màu sắc khuẩn lạc cũng như về đặc điểm sinh
bào tử tương ứng với loài nấm thán thư C. gloeosporioides được phân lập ở xoài theo mô tả của Ashutosh và cộng sự [54], Snowdon [181] và Zakaria và cộng sự [216]. Các chủng D1, D2, D3 có tính tương đồng về hình thái màu sắc khuẩn lạc với chủng C. musae được phân lập trên chuối [157], [173], [181] và các chủng B1, B4 tương đồng với C. capsici được phân lập trên ớt [182], [188].
Hình 3.9. Đặc điểm hình thái nấm thán thư phân lập từ vết bệnh trên xoài Để kiểm chứng các chủng trên, luận án tiến hành gây nhiễm bệnh trên quả bằng huyền phù bào tử nấm của các chủng nấm nghi ngờ (8 chủng) qua vết thương nhân tạo trên quả xoài, chuối, ớt lành bệnh đã được khử trùng. Kết quả quan sát đặc điểm vết bệnh, tái phân lập, làm thuần và giám định lại dưới kính hiển vi trình bày ở bảng 3.3 cho thấy sau 7 - 10 ngày lưu giữ ở 25oC, 100% vết gây nhiễm với mẫu bào tử nấm L2, D1 và B4 phát triển bệnh thán thư đặc trưng với một vài khác biệt không đáng kể so với vết bệnh thán thư trên quả nhiễm bệnh tự nhiên thu thập ban đầu. Trong khi đó, mẫu bào tử L1, D3, B1 chỉ gây bệnh thán thư với tỷ lệ bệnh tương ứng chỉ là 16,7%, 20%, 13,3% và mẫu bào
Chủng C1 Chủng C2
Chủng L1 Chủng L2
Chủng L3 Chủng L4
tử C1, D2 lại không có biểu hiện điển hình của bệnh thán thư sau khi gây nhiễm nhân tạo.
Chủng D1 Chủng D2
Chủng D3
Chủng T1 Chủng T2
Hình 3.10. Đặc điểm hình thái nấm thán thư phân lập từ vết bệnh trên chuối
Chủng B1 Chủng B2
Chủng B3 Chủng B4
Hình 3.11. Đặc điểm hình thái nấm thán thư phân lập từ vết bệnh trên ớt
Bảng 3.3. Kết quả gây bệnh nhân tạo trên quả bằng các chủng nấm thán thư đã phân lập
Mẫu gây nhiễm Tỷ lệ bệnh sau gây nhiễm (%) Kết quả tái phân lập (%)
ĐC 0 0
C1 0 -
L1 16,7 36
L2 100 100
D1 100 100
D2 0 -
D3 20 46,7
B1 13,3 30
B4 100 100
Từ kết quả phân tích ở bảng 3.3 có thể khẳng định các chủng nấm L2, D1 và B4 là tác nhân chính gây bệnh thán thư tương ứng trên các loại quả xoài, chuối, ớt đã thu thập mẫu bệnh phẩm. Mặt khác, luận án cũng tiến hành phân tích các đặc điểm đại thể (trên cỏc mụi trường PDA, ẵ PDA, 1/5 PDA) và vi thể của cỏc chủng L2, D1 và B4 tỏi phõn lập, so sánh với hình thái ban đầu (Hình 3.12 - 3.17 và bảng 3.4) cho thấy đặc điểm hình thái của các chủng nấm thán thư tái phân lập không thay đổi so với hình thái của các chủng nấm L2, D1 và B4 ban đầu.
PDA ẵ PDA 1/5 PDA
Hình 3.12. Hình thái khuẩn lạc của chủng L2 phân lập từ trái xoài trên môi trường PDA
Hình ảnh về cành bào tử phân sinh Hình ảnh về bào tử phân sinh Hình 3.13. Đặc điểm vi thể của chủng L2 phân lập từ trái xoài
PDA ẵ PDA 1/5 PDA
Hình 3.14. Hình thái khuẩn lạc của chủng D1 phân lập từ chuối trên môi trường PDA
Hình ảnh về cành bào tử phân sinh Hình ảnh về bào tử phân sinh Hình 3.15. Đặc điểm vi thể của chủng D1 phân lập từ chuối
PDA ẵ PDA 1/5 PDA
Hình 3.16. Hình thái khuẩn lạc của chủng B4 phân lập từ chuối trên môi trường PDA
Hình ảnh về cành bào tử phân sinh Hình ảnh về bào tử phân sinh Hình 3.17. Đặc điểm vi thể của chủng B4 phân lập từ ớt Bảng 3.4. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng L2, D1 và B4 Chủng
nấm Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể
L2
Trên các môi trường PDA tản nấm xốp, có màu trắng xám (1/5PDA) đến xám đậm (PDA), tản nấm mọc thưa và yếu hơn trên môi trường 1/2 và 1/5 PDA, sợi nấm phân nhánh, đa bào (Hình 3.12).
Bào tử phân sinh hình trụ với các đầu hơi tù, đỉnh tròn, cuống hẹp, trong suốt, không có vách ngăn, hình thành trên các cành bào tử phân sinh hình trụ trong, khối bào tử có màu hồng nhạt đến trắng xám (Hình 3.13).
D1
Tản nấm mọc đều, xốp, các sợi nấm mọc dày ở giữa và thưa dần về mép đĩa. Sợi nấm đâm nhánh, đa bào, có màu trắng đến hồng cam; ở trên môi trường 1/5 PDA tản nấm mọc thưa, mỏng có màu trắng hồng nhạt (Hình 3.14).
Cành bào tử phân sinh không màu, phân nhánh và có ngăn ngang. Bào tử phân sinh không màu, đơn bào hình oval hoặc elip, đầu tròn. Trên mỗi bào tử phân sinh có chấm sáng, bên trong có dạng hạt thường xuất hiện ở gần tâm của bào tử (Hình 3.15)
B4
Tản nấm có màu trắng đến màu trắng xám nâu xẫm, khuẩn lạc mọc dày, xốp, phồng lên ở giữa và mỏng dần về phía mép đĩa. Ở môi trường PDA, dày và mịn, bề mặt tản nấm trắng xám, quan sát rõ các vòng tròn đồng tâm. Ở các môi trường 1/2 PDA và 1/5 PDA sợi nấm mờ và thưa dần, không còn nhìn thấy các vòng tròn đồng tâm ở môi trường 1/5 PDA (Hình 3.16).
Bào tử phân sinh đơn bào, không màu, dạnh hơi cong hình lưỡi liềm, trong suốt ở bên trong. Bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử.
Cùng với bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài, thuôn nhọn có màu nâu (Hình 3.17).
Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra với đặc điểm đa dạng, phức tạp về hình thái và biểu hiện bệnh khó phân biệt trên nhiều ký chủ ở thời điểm cận và sau thu hoạch. Việc xuất hiện các chủng khác nhau trên vết bệnh thán thư ở quả sau thu hoạch có thể giải thích do hiện tượng bội nhiễm cộng sinh trên cùng một vết bệnh ở điều kiện tự nhiên [70], [125], sự khác biệt về điều kiện xâm nhập và phát triển nấm bệnh (vết xâm nhiễm, thành phần dinh dưỡng khác nhau ở các thời điểm chín của quả, nhiệt độ và độ ẩm môi trường) và đặc điểm sinh dưỡng của nấm bệnh thán thư [44], [60], [70], [125], [151], [157], [181]. Bên cạnh các loài nấm gây bệnh thán thư đặc trưng như C.
gloeosporioides trên xoài, C. musae trên chuối hay C. capsici trên ớt, nấm C. acutatum và C. truncatum thường xuất hiện trên vết bệnh thán thư không chỉ trên xoài mà còn cả ớt sau thu hoạch với hình thái tương đồng [29], [54], [60]. Ngoài ra, hiện tượng bội nhiễm các loài nấm thán thư đặc trưng thuộc chi Colletotrichum ở các vùng địa lý khác cũng được chỉ ra trên xoài, chuối và ớt. Tại Malaysia, các nhà khoa học đã phát hiện 35 chủng nấm thuộc hai loài C. gloeosporioides và C. asianum được phát hiện đồng thời trên 2 giống xoài và 38 chủng thuộc hai loài C. gloeosporioides và C. musae từ 5 giống chuối bản địa [173], [216]. Tại Thái Lan các nhà khoa học cũng phát hiện được ba loài C. acutatum, C. capsici và C. gloeosporioides gây bệnh thán thư phổ biến ở ớt và tại Brazil các nhà khoa học lại phát hiện từ 5 - 13 chủng thuộc chi Colletotrichum gây bệnh thán thư ở ớt sau thu hoạch [120], [188].
Tóm lại, từ kết quả quan sát đặc điểm hình thái (đại thể và vi thể) khi sử dụng các chủng L2, D1, B4 gây nhiễm bệnh thán thư nhân tạo trên quả sau thu hoạch cho thấy các chủng L2, D1, B4 phân lập được là tác nhân chính gây bệnh thán thư tương ứng trên xoài, chuối và ớt.