Châu Âu
Grupcheva và Nedeva (1999) tiến hành nghiên cứu KST trên cá diếc phổ thu trong hồ chứa Zrebchevo ở Bun-ga-ri. Thời gian thực hiện từ năm 1994 - 1996. Kết quả tác giả đã công bố bắt gặp 29 loài KST trong đó có 9 loài thuộc lớp sán lá đơn chủ; 3 loài thuộc lớp sán lá song chủ; lớp sán dây, lớp giun đầu gai và động vật đơn bào thuộc lớp Coccidian 1 loài và 13 loài thuộc lớp Infuzorian. Tác giả cũng cho biết ở Bun-ga-ri trên cá diếc phổ tìm thấy ít nhất 44 loài KST bao gồm 15 loài sán lá đơn chủ; 3 loài thuộc lớp sán lá song chủ; lớp sán dây, lớp giun đầu gai và động vật đơn bào thuộc lớp Coccidian 1 loài; lớp Infuzorians 18 loài; lớp bào tử sợi (Myxosporea) 2 loài và lớp Flagellates 3 loài [33].
Karvonen, Bagge và Valtonen (2005) đã tiến hành nghiên cứu về: mối quan hệ về thành phần KST đối với cá diếc châu Âu sống ở ao và ở hồ nhằm đánh giá sự trao đổi
KST giữa các loài cá khác nhau với cá diếc châu Âu cũng như sự đặc hữu ký chủ đối với các loài KST. Kết quả cho thấy chỉ có rất thấp loài sán lá Diplostomum spathaceum ký sinh trong mắt cá diếc châu Âu. Thí nghiệm cảm nhiễm loài sán lá này cũng được kiểm chứng trong phòng thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng cá diếc châu Âu hoàn toàn có khả năng chống miễn nhiễm với loài sán lá này, điều này được giải thích là do không phù hợp sinh lý của loài KST này với cá diếc châu Âu [42].
Châu Mỹ
Có ít nhất 14 loài sán đơn chủ thuộc giống Dactylogyrus được tìm thấy ký sinh trên cá diếc châu Âu bao gồm: Dactylogyrus anchoratus (Wagener, 1857); D. anchoratus carassii (Jin và Sproston), 1949; D. anchoratus geei (Jin và Sproston), 1949; D. arcuatus (Yamaguti, 1942); D. crassus (Kulwieć, 1927); D. dulkeiti
(Bychowsky, 1936); D. fallax (Wagener, 1857); D. forrmosus (Kulwieć, 1927); D. geei (Jin và Sproston, 1948); D. inexpectatus (Isjumova, 1955); D. intermedius
(Wegener, 1909); D. spiralis (Yamaguti, 1942); D. vastator (Nybelin, 1924) và D. wegeneri (Kulwieć, 1927) [67].
Trên cá diếc phổ bắt gặp 4 loài ký sinh bao gồm: Dactylogyrus dulkeiti
(Bychowsky, 1936); D. geei (Jin và Sproston, 1948); D. inexpectatus Isjumova, 1955 và D. dogieli Gusev, 1955. Trong đó 3 loài là D. dulkeiti Bychowsky, 1936; D. geei
(Jin và Sproston, 1948) và D. inexpectatus (Isjumova, 1955) được báo cáo là ký sinh trên cả hai loài cá, cá diếc châu Âu và cá diếc phổ [67].
Châu Á
Thổ Nhĩ Kỳ: Vào tháng 8, tháng 11 năm 2003 và tháng 2 năm 2004 Soylu và Emre đã tiến hành nghiên cứu KST đa bào của cá diếc châu Âu thu từ ao chứa của nhà máy thủy điện Kepez I, Antalya, Thổ Nhĩ Kỳ. Có 89 mẫu cá diếc châu Âu đã được nghiên cứu. Kết quả thu được 2 loài KST là Dactylogyrus vastator (Nybelin, 1924) (Monogenea) và Diplostomum sp. (Trematoda) [61].
Koyun và Antunel (2007) nghiên cứu KST ký sinh trên cá diếc châu Âuthu tại hồ Enne Dam, Thổ Nhĩ Kỳ. Kết quả đã thu được 2 loài sán lá đơn chủ: Dactylogyrus anchoratus, Gyrodactylus katherineri và 1 loài giun tròn (Contracaecum sp.) ký sinh trên cá diếc châu Âu [45].
Iran: Rasouli và cộng sự (2011) đã công bố tìm thấy 7 loài KST ngoại ký sinh là
Diplostomum spathaceum, Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyophthirius multifiliis, Trichodinia sp., Chilodonella sp. và Argulus sp. trên cá diếc châu Âu thu ở tỉnh West Azerbaijan thuộc phía Tây Bắc của Iran [58].
Việt Nam: Năm 2007, Hà Ký và Bùi Quang Tề đã xuất bản cuốn sách “Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam” cuốn sách đã mô tả rất nhiều giống loài KST ký sinh trên cá nước ngọt Việt Nam. Trong đó, tác giả đã mô tả được tổng cộng 16 loài KST ký sinh trên cá diếc gồm: 6 loài sán lá đơn chủ, 4 loài sán dây, 4 loài sán lá song chủ, 2 loài giáp xác [8].
Bùi Quang Tề (1997) đã công bố bắt gặp loài Gyrodactylus medius ký sinh trên cá diếc [13].
Qua tình hình nghiên cứu về KST ký sinh trên cá diếc trên thế giới và Việt Nam cho thấy: hiện nay đa số các công trình nghiên cứu về KST ký sinh trên cá diếc chủ yếu tập trung vào 2 loài là cá diếc châu Âu và cá diếc phổ chưa có công trình nghiên cứu KST ký sinh trên cá diếc mắt đỏ. Các công trình nghiên cứu về cá diếc mắt đỏ ở Việt Nam chưa nhiều và đặc biệt hơn là công trình nghiên cứu về KST đang còn hạn chế. Các công trình nghiên cứu này chủ yếu tiến hành ở các tỉnh thuộc khu vực phía Bắc nước ta và hai tỉnh ở miền Trung là Quảng Ngãi và Bình Định. Phú Yên là một trong những tỉnh thuộc miền Trung nằm sát ranh giới với Bình Định. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về KST trên cá diếc. Xuất phát từ vấn đề này, nghiên cứu KST ký sinh trên cá diếc mắt đỏ tại tỉnh Phú Yên là một trong những hướng nghiên cứu tiếp theo cần tiến hành nhằm cung cấp thêm thông tin về thành phần loài KST trên cá diếc.
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Thành phần loài KST ký sinh trên cá diếc mắt đỏ (Carassiusauratus auratus (Linnaeus, 1758)) tại tỉnh Phú Yên.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3/2011 đến tháng 3/2012.
Địa điểm nghiên cứu: mẫu cá được thu mua từ người dân đánh bắt hay các chợ An Mỹ, Chí Thạnh thuộc huyện Tuy An và chợ Hòa Xuân Đông thuộc huyện Đông Hòa tỉnh Phú Yên (Hình 2.1). Phân tích mẫu tại Phòng Sinh học Thực nghiệm - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III - Nha Trang - Khánh Hòa.
Hình 2.1. Các địa điểm thu mẫu KST của cá diếc ở Phú Yên [79, 81]
1 Chí Thạnh 2 An Mỹ 3 Hòa Xuân Đông 1
2
2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
2.3. Phương pháp thu, giữ mẫu cá phục vụ nghiên cứu
- Mẫu cá được thu hoàn toàn ngẫu nhiên từ người dân đánh bắt hay các chợ: + Chợ An Mỹ - Huyện Tuy An
+ Chợ Chí Thạnh - Huyện Tuy An (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Chợ Hòa Xuân Đông - Huyện Đông Hòa thuộc tỉnh Phú Yên. - Mỗi lần thu 15 - 30 con với các kích cỡ khác nhau.
- Mẫu cá sống được cho vào thùng xốp đựng nước ngọt có sục khí, vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích. Khi thu mẫu kết hợp ghi chép các thông tin về thời
Kiểm tra phát hiện KST ngoại ký sinh, nội ký sinh và thu thập mẫu KST. Cân khối lượng và đo chiều dài cá Nghiên cứu KST trên cá diếc tại
tỉnh Phú Yên
Thu mẫu cá ngẫu nhiên từ người dân đánh bắt hay các chợ thuộc huyện Tuy
An và Đông Hòa tỉnh Phú Yên
Ép mẫu và soi tươi. Làm tiêu bản KST. Đo, đếm và mô tả đặc điểm hình thái KST. Cố định và bảo quản KST. Phân loại, xác định thành phần KST ký sinh. Xác định TLCN và CĐCN. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
gian, địa điểm thu mẫu. Cá thu về trong thời gian nghiên cứu được nuôi trong bể composite chứa nước ngọt có sục khí.
- Tổng cộng có 201 mẫu cá diếc bao gồm: 64 mẫu ở xã An Mỹ, 55 mẫu ở Chí Thạnh thuộc Huyện Tuy An và 82 mẫu ở xã Hòa Xuân Đông thuộc huyện Đông Hòa tỉnh Phú Yên được sử dụng để nghiên cứu KST.
Kích cỡ và số lượng cá được trình bày ở Bảng 2.1
Bảng 2.1. Số lượng và kích cỡ trung bình của mẫu cá diếc nghiên cứu theo từng địa phương
Nơi thu mẫu Số mẫu (con) Chiều dài (mm) Khối lượng (g)
An Mỹ 64 107,4 ± 33,5 (60,0 – 200,0) 27,6 ± 31,7 (2,9 – 155,2) Chí Thạnh 55 128,6 ± 12,4 (95,0 – 155,0) 40,2 ± 17,2 (11,9 – 119,2)
Hòa Xuân Đông 82 124,9 ± 25,8
(80,0 – 195,0)
31,7 ± 20,3 (7,4 – 94,2)
Ghi chú: Số liệu trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Trong ngoặc đơn làgiá trị nhỏ nhất và lớn nhất
2.4. Phương pháp nghiên cứu KST
Các mẫu cá được phân tích theo phương pháp của Dogiel (1929) có bổ sung của Hà Ký (1969) (trích dẫn bởi Bùi Quang Tề, 2002).
2.4.1.Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu KST
Kính hiển vi, kính soi nổi, lam kính, lamel, dao giải phẫu, kéo, panh kẹp, hộp lồng, kim giải phẫu, cốc thủy tinh, đèn cồn, pipet các loại, khay đựng mẫu, cân, thước đo, nước muối sinh lý 0,85%, nước cất, cồn tuyệt đối, formol, carmin, nitrat bạc (AgNO3 2%), acid acetic, nhựa Canada và một số hóa chất khác.
2.4.2. Phương pháp kiểm tra phát hiện KST
Theo viện sỹ Dogiel có 2 phương pháp kiểm tra KST trên cá:
Kiểm tra toàn diện: giải phẫu và kiểm tra toàn bộ các cơ quan bên ngoài và bên trong của cá.
Kiểm tra từng phần: chỉ giải phẫu và kiểm tra một số cơ quan tập trung nhiều KST như: da, mang, ruột, thận, mật, …. Ở đây chúng tôi áp dụng phương pháp kiểm tra từng phần (chỉ giải phẫu và kiểm tra một số cơ quan tập trung nhiều KST).
Khi kiểm tra KST trên cá phải tuân theo một số nguyên tắc như sau:
Cá đưa vào kiểm tra KST phải còn sống hay vừa chết.
Kiểm tra bằng mắt thường trước, dụng cụ quang học sau.
Kiểm tra các cơ quan bên ngoài trước, các cơ quan bên trong sau.
Trước khi kiểm tra và thu thập KST, tiến hành phân loại cá diếc đến loài dựa vào khóa phân loại của Nguyễn Văn Hảo & Ngô Sỹ Vân (2001) [5]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kiểm tra ngoại ký sinh
• Trước khi kiểm tra đem cá cân và đo nhanh
- Dùng cân điện tử để xác định khối lượng cá với độ chính xác 0,1 g - Dùng thước để đo chiều dài cá với độ chính xác 1 mm.
• Kiểm tra da:
- Bắt cá, đặt lên khay men, quan sát bằng mắt thường: màu sắc, vây, vẩy,…Có thể thấy các hiện tượng bệnh lý như: da nhợt nhạt, vây cụt, vẩy mất, lở loét, trên da có những điểm tụ máu, dịch nhờn tiết ra nhiều,…Ngoài ra, có thể phát hiện thấy những KST có kích thước lớn ký sinh trên da, vẩy hay gốc vây của cá như: Lernaea,
Corallana, bào nang của Myxobolus,…
- Sau đó tiến hành cạo nhớt da, nên cạo đặc trưng trên toàn cơ thể, chú ý những nơi tập trung nhiều KST như: gốc vây, bụng cá. Lấy nhớt phết mỏng lên 2-4 lam kính, nhỏ thêm vài giọt nước muối sinh lý rồi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 4x10 hoặc 10x10. Khi phát hiện KST, đậy lamen lên rồi quan sát ở độ phóng đại lớn hơn để thấy rõ các bộ phận bên trong KST. Thu mẫu, làm tiêu bản, phân loại và xác định mức độ cảm nhiễm.
- Dưới kính hiển vi, trong nhớt da có thể gặp những KST có kích thước bé như: nguyên sinh động vật (Protozoa): Trichodina, Ichthyophthyrius,…và một số giống trong lớp sán lá đơn chủ (Monogenea): Dactylogyrus, Gyrodactylushoặc bọn giáp xác ký sinh Crustacea.
• Kiểm tra các vây, xương nắp mang: Dùng kéo cắt các vây, xương nắp mang cho
vào hộp lồng đựng nước ngọt lọc sạch rồi đem quan sát dưới kính soi nổi. Khi phát hiện KST dùng pipet hút trùng ra rửa sạch, cho lên lam kính đậy lamen xem tươi dưới
kính hiển vi, tiến hành vẽ, chụp hình, thu mẫu KST. Trên xương nắp mang, vây có thể gặp sán lá đơn chủ Gyrodactylus, trùng loa kèn Epistylis,…
• Kiểm tra mang:
- Cắt bỏ xương nắp mang rồi quan sát bằng mắt thường xem mang có màu sắc thế nào: đỏ tươi, đỏ sẫm hay nhợt nhạt, dịch nhờn trên mang tiết ra nhiều hay ít, tơ mang có bị rách nát hay không. Ngoài ra có thể thấy một số KST: Monogenea, Trùng bánh xe, Trùng quả dưa (Ichthyophthyrius), bào nang của Myxobolus, sán song thân,…
- Sau khi quan sát bằng mắt thường, ta cắt rời từng lá mang (chú ý cắt sát xương cung mang để chảy ít máu, dễ quan sát) rồi cho vào hộp lồng có đựng nước ngọt và quan sát dưới kính soi nổi. Khi phát hiện KST dùng kim giải phẫu tách trùng cho lên lam kính, đậy lamen lên quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại từ nhỏ đến lớn. Sau đó lấy nhớt mang cho lên 2-4 lam với cá lớn, còn cá nhỏ thì cạo hết nhớt cho lên 1 lam, nhỏ thêm nước ngọt lọc sạch, đậy lamen rồi quan sát dưới kính hiển vi với các độ phóng đại từ nhỏ đến lớn có thể phát hiện trùng bánh xe, sán lá đơn chủ,….
Kiểm tra nội ký sinh
Sau khi kiểm tra xong da và mang ta bắt đầu giải phẫu cá để kiểm tra cơ quan bên trong của cá. Đặt cá nằm trên khay men, dùng kéo nhọn rạch một đường cong từ hậu môn lên phía trước, cắt bỏ một bên vách bụng. Để nguyên như vậy quan sát bằng mắt thường, xem xét các dấu hiệu bất thường và các KST có kích thước lớn.
Sau đó, dùng kéo cắt ruột sau ở sát hậu môn, ruột trước ở sát hầu để lấy toàn bộ nội tạng ra ngoài. Dùng panh tách riêng từng bộ phận: tim, gan, thận, mật, ruột,.. các cơ quan nội tạng được cho vào nước muối sinh lý rồi tiến hành kiểm tra KST ở từng cơ quan.
Tim: Cắt thành các mẫu nhỏ cho lên lam kính, dùng lam khác để ép mỏng tim sau đó quan sát dưới kính hiển vi.
Gan: Quan sát màu sắc, hình dạng của gan, cắt gan thành các mẫu nhỏ cho lên lam kính, dùng lam khác để ép mỏng gan cho thêm một giọt nước muối sinh lý, sau đó quan sát dưới kính hiển vi. Ở gan có thể gặp bào nang của Myxobolus.
Thận: Cắt thành các mẫu nhỏ và ép mỏng trên 2 tấm lam, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý, đậy lamel và quan sát.
Mật: Tách túi mật, dùng kéo cắt và nhỏ dịch mật lên lam kính, đậy lamen và quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại 40x10 để phát hiện KST.
Ruột: Chia làm 3 phần: ruột trước, ruột giữa và ruột sau, tùy thuộc vào mỗi loài cá mà chiều dài ruột thay đổi do tập tính ăn của chúng. Dùng kéo cắt dọc ống ruột, gạt nhẹ phần thức ăn, quan sát bằng mắt thường sau đó dùng dao cạo nhớt đưa lên lam, nhỏ vài giọt nước muối sinh lý, đậy lamen lại và đưa lên kính hiển vi quan sát. Nếu phát hiện KST thì chuyển sang kính giải phẫu để tách trùng.
Cơ: Dùng dao cắt phần thịt trên cơ thể cá, dùng 2 tấm lam ép mạnh vào nhau, kiểm tra dưới kính soi nổi, kính hiển vi. Có thể bắt gặp ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ.
2.4.3. Phương pháp thu thập, cố định và bảo quản KST
Các loại KST khác nhau thì có phương pháp thu thập, cố định và bảo quản khác nhau.
2.4.3.1. KST thuộc ngành nguyên sinh động vật (Protozoa)
Do trùng có kích thước nhỏ không thể nhìn được bằng mắt thường nên khi quan sát thấy ở nhớt da, nhớt mang có nhiều KST thuộc ngành Protozoa cần tiến hành thu mẫu bằng phương pháp phết kính.
Thu mẫu bằng phương pháp phết kính: Lấy 1 lam sạch đặt lên lam có chứa trùng nghiêng và kéo nhẹ cho lớp nhớt trên lam thật mỏng. Thả các lam vào dung dịch Shandine, úp mặt có trùng xuống nước, sau đó lật lại và dìm toàn bộ lam vào dung dịch. Sau 10-15 phút, rửa các lam qua nước cất rồi cho vào cồn 70o trong thời gian 5- 10 phút, sau đó nhúng vào cồn Iod 10-15 phút (để khử HgCl2 có trong Shandine). Cuối cùng bảo quản trong cồn 70o.
Riêng KST thuộc các giống Trichodina, Chilodonella ngoài cách thu trên (để nhuộm bằng Hematoxyline) thì còn có thể thu thập và cố định bằng cách đơn giản hơn (để nhuộm Nitrat bạc AgNO3): lấy nhớt da, mang có nhiều trùng phết lên lam kính sạch, phết xong để khô tự nhiên tránh bụi bẩn.
2.4.3.2. Ký sinh trùng thuộc lớp sán lá đơn chủ (Monogenea) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Một số giống loài thuộc sán lá đơn chủ trên cá nước ngọt như: Dactylogyrus,
Gyrodactylus,… có kích thước nhỏ, không thể nhìn thấy bằng mắt thường. Để thu mẫu ta dùng dùi nhỏ tách riêng từng con trùng ra khỏi tơ mang dưới kính giải phẫu (không làm dưới kính hiển vi vì ở độ phóng đại lớn khó tách trùng). Sau đó dùng ống hút rất nhỏ hút trùng ra và tiến hành làm tiêu bản ngay.
Riêng giống Eudiplozoon và một số giống sán lá đơn chủ ký sinh trên mang cá nước ngọt có kích thước lớn, ta tiến hành thu mẫu giống như sán lá song chủ. Sau khi phát hiện thấy trùng ta dùng panh, kim giải phẫu tách trùng ra khỏi cơ quan ký sinh, cho vào hộp lồng chứa nước muối sinh lý rửa cho thật sạch. Đưa trùng lên lam và lấy