CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các chỉ tiêu nghiên cứu
2.4.3. Đánh giá hiệu lực bảo vệ
Hiệu lực bảo vệ của vắc xin (VE) trong nghiên cứu này được ước tính bằng mô hình nguy cơ tương xứng Cox (Cox Proportional Hazard Model). Đây là một mô hình sử dụng cho các biến số thuộc phân loại “thời gian dẫn đến một sự kiện” hay “time-to-event”, cụ thể trong nghiên cứu này là thời gian kể từ khi bắt đầu tiêm SPNC cho đến thời điểm có ca bệnh mắc COVID-19 đầu tiên, hoặc thời gian từ 7 ngày sau tiêm mũi hai đến khi có ca bệnh mắc COVID-19 đầu tiên. Mô hình Cox là mô hình cho phép biểu diễn biến số phụ thuộc (time- to-event) theo các biến độc lập (nhóm sử dụng giả dược hoặc vắc xin) và cho phép kiểm soát được các hiệp biến (ví dụ như giới tính, tuổi, nhóm có nguy cơ mắc bệnh nặng…). Mô hình Cox cho phép ước lượng tỷ số nguy hại (Hazard Ratio- HR) giữa nhóm can thiệp và nhóm chứng và từ đó tính toán được hiệu lực bảo vệ của vắc xin qua công thức VE= 1- HR.
Hiệu lực của vắc xin (VE) được định nghĩa là phần trăm số người giảm tỷ lệ nhiễm bệnh trên tổng số người được tiêm chủng. Cho rằng rủi ro tương đối là RR, tỷ lệ mắc COVID-19 trong số các đối tượng tiêm giả dược là Ip và trong số các đối tượng đã tiêm VXNC là Iv, VE được tính như sau [146]:
VE (%) = (1-RR) × 100 = (1- Iv/Ip) × 100 = [(Ip-Iv)/Ip] × 100
Theo dõi và đánh giá VE được thực hiện trên các đối tượng thuộc nhóm B và C (giai đoạn 2 và 3). VE của vắc xin Nanocovax được đánh giá bằng số ca bệnh mắc COVID-19 trên đối tượng đã tiêm 2 mũi VXNC, trên toàn bộ 13.246 đối tượng nghiên cứu (hoặc trên số đối tượng mà việc phân tích thống kê tại một số thời điểm, đánh giá được VE bảo vệ của Nanocovax).
Xác định VE của vắc xin thông qua việc xác định ca mắc COVID-19 và tình trạng của ca bệnh (theo định nghĩa tiêu chuẩn bệnh), bao gồm:
+ Số ca mắc COVID-19 không có triệu chứng lâm sàng, được xác nhận về mặt vi rút học RT-PCR (+) dịch tỵ hầu, xảy ra sau 14 ngày sau tiêm mũi 2, so với giả dược, cho đến thời điểm đạt số ca mắc.
+ Số ca mắc COVID-19 có triệu chứng lâm sàng nhẹ đến trung bình, nặng, tử vong và được xác nhận về mặt vi rút học RT-PCR (+) dịch tỵ hầu, xảy ra sau 14 ngày sau tiêm mũi 2, so với giả dược, cho đến thời điểm đạt số ca mắc.
❖ Định nghĩa tiêu chuẩn ca bệnh mắc COVID-19
Ca bệnh mắc COVID-19 để đưa vào quần thể phân tích hiệu lực bảo vệ phải đáp ứng được các tiêu chí sau:
+Được xác nhận về mặt vi rút học (RT-PCR (+) dịch tỵ hầu), xảy sau 14 ngày (từ ngày 15) sau tiêm mũi 2 VÀ
+ Có triệu chứng mắc COVID-19 xảy sau 14 ngày (từ ngày 15): Có ít nhất 2 triệu chứng toàn thân (Sốt (≥ 38°C), ớn lạnh, đau cơ, đau đầu, đau họng, mất khứu giác, vị giác) HOẶC có ít nhất 01 triệu chứng/dấu hiệu đường hô hấp (Ho, hụt hơi hoặc khó thở, có triệu chứng lâm sàng hoặc X quang có viêm phổi).
❖ Quy trình theo dõi và ghi nhận ca Covid-19 trong nghiên cứu
Nếu đối tượng có các yếu tố dịch tễ liên quan đến Covid-19 HOẶC nếu đối tượng có bất kỳ 2 triệu chứng toàn thân hoặc 1 triệu chứng đường hô hấp vào bất kỳ thời điểm nào trước khi kết thúc nghiên cứu và kéo dài trong vòng ít nhất 48 giờ (ngoại trừ sốt và/hoặc các dấu hiệu hô hấp):
+ Triệu chứng toàn thân: Sốt (≥ 38°C); Ớn lạnh; Mệt mỏi (kéo dài ≥ 48 giờ); Đau cơ (kéo dài ≥ 48 giờ); Đau đầu (kéo dài ≥ 48 giờ); Đau họng (kéo dài
≥ 48 giờ); Mất khứu giác hoặc vị giác (kéo dài ≥ 48 giờ); Đau hoặc tức ngực (kéo dài ≥ 48 giờ).
+ Triệu chứng hô hấp: Ho khan dai dẳng; Hụt hơi hoặc khó thở.
- Bộ phận liên lạc chăm sóc sức khỏe 24/7 sẽ kết nối với những người tham gia nghiên cứu. Những người tham gia sẽ được hướng dẫn để gọi số điện thoại nóng vào bất kỳ lúc nào phát hiện bệnh.
- Người tham gia sẽ được nhân viên nghiên cứu liên lạc theo lịch thăm khám (hoặc thường xuyên hơn mà không hạn chế) qua điện thoại để hỏi xem
liệu người tham gia có gặp phải bất kỳ dấu hiệu/triệu chứng nào nghi ngờ COVID-19.
- Trường hợp đối tượng phải theo dõi, cách ly, làm xét nghiệm RT-PCR theo chương trình của Trung tâm kiểm soát bệnh tật (Control disease center:
CDC), sẽ thu thập, lưu giữ kết quả xét nghiệm RT-PCR, hồ sơ sức khoẻ, xác nhận của CDC như tài liệu nguồn.
- Những trường hợp không theo chương trình theo dõi của CDC và nghi ngờ mắc COVID-19 sẽ được lấy mẫu và xét nghiệm bằng phương pháp RT- PCR trong vòng 72 giờ tính từ thời điểm khởi phát triệu chứng tại phòng xét nghiệm được chỉ định (trừ trường hợp sau 14 ngày, đối tượng tiếp xúc gần với người nghi nhiễm COVID-19 và đã hết các triệu chứng lâm sàng).
- Những người có kết quả âm tính trong lần xét nghiệm đầu tiên sẽ có lần xét nghiệm thứ hai hoặc thứ ba vào 07 ngày và 14 ngày sau nếu các triệu chứng vẫn không giảm. Những người có kết quả dương tính, cần liên hệ CDC địa phương để tuân thủ phác đồ điều trị và cách ly, đảm bảo an toàn cho cộng đồng.
- Những người tham gia có triệu chứng sẽ được đánh giá thường xuyên cho đến khi các triệu chứng thuyên giảm.
2.5. Các kỹ thuật nghiên cứu 2.5.1. Xác định các biến cố bất lợi
Xác định các AE trong dự kiến xuất hiện trong vòng 60 phút và 7 ngày, các SAE, MAAE, AESI sau tiêm vắc xin bằng kỹ thuật khám lâm sàng (do các bác sỹ Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học – Học viện Quân y, Trung tâm Y tế Huyện Văn Lâm, Văn Giang, Khoái Châu, Phù Cừ, Mỹ Hào, Tiên Lữ, Yên Mỹ (tỉnh Hưng Yên); Bến Lức (tỉnh Long An); Tân Phước, Cai Lậy (tỉnh Tiền Giang) thực hiện).
2.5.2. Xét nghiệm cận lâm sàng
Tất cả các mẫu máu thu được sẽ bảo quản, vận chuyển và xét nghiệm tại các điểm nghiên cứu đạt tiêu chuẩn chất lượng theo quy trình đã phê duyệt.
2.5.2.1. Các xét nghiệm thường quy
- Xét nghiệm huyết học được thực hiện trên máy Unicel DxH600 tại khoa Huyết học Bệnh viện Quân y 103 và máy Celldyn Ruby tại khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
- Các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện trên máy AU5800 tại khoa Sinh hóa Bệnh viện Quân y 103 và máy AU680 tại khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
- Xét nghiệm SARS-CoV-2 trong mẫu dịch tỵ hầu bằng kỹ thuật realtime RT- PCR thực hiện trên máy Rotor-Gene Q MDx 5plex tại Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y và máy Stratagene MX3005P tại khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
2.5.2.2. Xét nghiệm đánh giá sinh miễn dịch
Được thực hiện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bao gồm:
❖ Phương pháp xét nghiệm AntiS-IgG
- Xét nghiệm định lượng nồng độ AntiS-IgG của SARS-CoV-2 với kít Siemens bằng phương pháp hóa phát quang sử dụng kit ADVIA Centaur SARS-CoV-2 IgG (sCOVG) của Siemens.
- Xét nghiệm được thực hiện trên máy miễn dịch Centaur XP/XPT theo chế độ chạy mẫu tự động. Hệ thống báo cáo kết quả theo giá trị Index, với công thức chuyển đổi: 1.00 Index = 1.00 U/mL. Kết quả được diễn giải [147]:
+ Không phản ứng: Index < 1,00. Các mẫu này được coi là âm tính đối với kháng thể IgG kháng SARS-CoV-2.
+ Phản ứng: Chỉ số ≥ 1,00. Các mẫu này được coi là dương tính đối với kháng thể IgG kháng SARS-CoV-2.
+ Khoảng đo: 0,50 – 150,00 Index.
BAU (Binding Antibody Units)/ml: Đơn vị kháng thể liên kết/ một đơn vị thể tích. Là đơn vị do WHO đề xuất chuẩn hóa bất kỳ xét nghiệm nào theo tiêu chuẩn quốc tế của WHO, bằng cách áp dụng hệ số chuyển đổi theo đề xuất
của nhà sản xuất. Công ty Siemens chuyển đổi đơn vị U/ml sang BU/ml. Hệ số chuyển đổi: 1 U/ml = 21,8 BU/ml [148].
❖ Phương pháp xét nghiệm sVNT
Sử dụng kit cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit của Genscript, dựa theo phương pháp ELISA cạnh tranh. Xét nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Theo đó, các mẫu thử, đối chứng dương và đối chứng âm được trộn với thuốc thử HRP-RBD (# S1-30) với tỷ lệ thể tích 1:1 trong các ống riêng biệt, rồi ủ hỗn hợp ở 370C trong 30 phỳt. Sau đú, 100àL của hỗn hợp chứng dương, hỗn hợp chứng õm và hỗn hợp mẫu được thêm vào các giếng tương ứng trong phiến nhựa vi lượng 96 giếng, phiến được ủ ở 370C trong 15 phỳt. Rửa phiến bằng 260àL dung dịch rửa 1X trong bốn lần và loại bỏ chất lỏng còn lại trong giếng sau các bước rửa. Thêm 100àL TMB Solution (# S1-40) vào mỗi giếng và ủ phiến trong búng tối ở 20- 250C trong 15 phút (bắt đầu tính thời gian sau khi thêm dung dịch TMB vào giếng đầu tiờn); thờm 50àL dung dịch dừng (# S1-50) vào mỗi giếng để ngừng phản ứng và đọc ngay độ hấp thụ ở bước sóng 450nm.
Mỗi lần xét nghiệm đều phải thực hiện cả 2 mẫu chứng dương, 2 mẫu chứng âm. Giá trị OD450 của mẫu chứng phải thỏa tiêu chí sau:
Kết quả Giá trị OD450
Chứng âm > 1,0
Chứng dương < 0,3
Giá trị OD (Optical density: mật độ quang) của chứng âm được sử dụng để tính tỉ lệ phần trăm ức chế. Kết quả của mỗi mẫu được tính theo công thức:
Tỷ lệ ức chế (%) = (1 − OD mẫu/ OD chứng âm) × 100%.
Kết quả mẫu được diễn giải như sau:
Ngưỡng
(cut off) Kết quả Giải thích kết quả
≥ 30 % Dương tính Có kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm.
≤ 30 % Âm tính Không có kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 trong mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm.
Đơn vị: % (tỷ lệ % trung hòa)
❖ Phương pháp xét nghiệm PRNT50
Sử dụng dòng tế bào cảm nhiễm Vero E6 tạo đám hoại tử (plaque) khi bị nhiễm vi rút. Tế bào Vero E6 được nuôi cấy trong môi trường tăng sinh để tạo độ bao phủ gần hết bề mặt nuôi. Các mẫu huyết thanh bất hoạt bằng nhiệt được pha loãng bậc 2 trong DMEM có bổ sung NHCO3, đệm HEPES, penicillin, streptomycin và 1% huyết thanh bào thai bò (FBS), bắt đầu ở độ pha loãng 1/20; sau đó cho vào cùng thể tích huyền phù vi rút SARS-CoV-2 nồng độ 103 PFU/mL và ủ ở 370C trong 30 phút. Sau khi ủ, hỗn hợp được bổ sung vào tế bào Vero E6 đang được nuôi cấy trên đĩa 24 giếng và ủ trong 72 - 96 giờ. Các tế bào được cố định bằng 4% formaldehyde/PBS và nhuộm bằng kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV-2 của thỏ (kháng thể sơ cấp) và kháng thể kháng IgG thỏ liên hợp peroxidase (kháng thể thứ cấp). Tín hiệu được phát triển trong cơ chất TMB. Số lượng tế bào bị nhiễm trên mỗi giếng ở mỗi độ pha loãng được đếm và ghi nhận. Hiệu giá trung hòa là nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất làm giảm hơn 50% đám hoại tử vi rút. Độ pha loãng cao hơn 20 lần được coi là dương tính(có khả năng trung hoà vi rút SARS-CoV-2 sống) hay có đáp ứng.
Trong huyết thanh có kháng thể trung hòa thì kháng thể sẽ trung hòa với vi rút làm nồng độ vi rút và số đám hoại tử tạo thành giảm đi so với ban đầu.
Dựa vào số đám hoại tử còn lại, xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút có trong mẫu bệnh phẩm.
Đơn vị: Số lần pha loãng huyết thanh. Giá trị PRNT50 <20 được gán là 10 để tính toán.
2.6. Các biện pháp khắc phục sai số
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại thực địa, chúng tôi đã cử cán bộ giám sát chặt chẽ các hoạt động về các nội dung theo đúng quy trình khi thiết kế nghiên cứu (phần phụ lục)
- Đối tượng tiêm: chọn đúng đối tượng theo tiêu chí nghiên cứu; lô vắc xin làm mù có đúng với mã số của đối tượng tình nguyện không?
- Kỹ thuật tiêm: số ml vắc xin tiêm cho đối tượng có đúng như ghi trên nhãn dành cho đối tượng đó không? Bảo quản vắc xin tại thực địa có đúng yêu cầu (2 - 8oC) không? Lấy máu có đủ số lượng không?
- Đồng thời, nhóm nghiên cứu chịu sự giám sát và kiểm tra của Bộ Y tế bất cứ khi nào được yêu cầu.
- Để loại trừ các sai số có thể xảy ra, nghiên cứu đã thực hiện biện pháp sau:
+ Đảm bảo tính đại diện của kết quả nghiên cứu bằng: cỡ mẫu nghiên cứu đủ lớn theo đúng quy định về thử nghiệm lâm sàng vắc xin mới; phân bổ ngẫu nhiên, nghiên cứu lặp lại để tăng tính chính xác của kết quả nghiên cứu.
+ Thiết kế nghiên cứu chặt chẽ, các công cụ thu thập số liệu là các biểu mẫu được chuẩn bị đầy đủ, chi tiết. Các kỹ thuật xét nghiệm đều được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Bệnh viện Quân y 103, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
+ Thu thập số liệu là các bác sỹ chuyên môn sâu và có kinh nghiệm về lĩnh vực nghiên cứu, được tập huấn về thực hành lâm sàng tốt, được thống nhất về cách thức thực hiện theo các giai đoạn nghiên cứu về tuyển chọn đối tượng;
điều tra, giám sát ghi chép thông tin được thực hiện thường xuyên, đầy đủ.
+ Các thuật toán thống kê thường dùng trong y học cũng đã được sử dụng tối đa để phân bổ đối tượng ngẫu nghiên và loại trừ các sai số ngẫu nhiên.
2.7. Xử lý và phân tích số liệu
Tất cả các hồ sơ, tài liệu, kết quả nghiên cứu được lưu trữ tại Học viện Quân y và Viện Pasteur TP.HCM. Số liệu sau khi thu thập sẽ được nhập vào
phần mềm quản lý dữ liệu lâm sàng điện tử của công ty MedProve (đơn vị quản lý dữ liệu độc lập) phiên bản 1.4.1.
Cỡ mẫu trong kiểm định giả thuyết về hiệu lực bảo vệ của vắc xin được tính toán bằng phần mềm R phiên bản 3.2.2. Cỡ mẫu trong so sánh tỷ lệ được tính toán bằng phần mềm trực tuyến của Trung tâm nghiên cứu lâm sàng và thống kê y sinh học của Trường Đại Học Hong Kong (Centre for Clinical Research and Biostatistics: CCRB), phiên bản cập nhật 2021. Số liệu được phân tích bằng phần mềm SAS® System 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC)..
Phân tích đặc điểm đối tượng: tuổi, giới, nhân trắc học... trên 13.266 người. Các chỉ số này mô tả bằng tỷ lệ (biến định tính) hoặc giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (biến định lượng).
Phân tích an toàn: thực hiện trên 13.266 đối tượng tiêm SPNC, chia làm 2 nhóm (nhóm tiêm VXNC và nhóm tiêm giả dược) để so sánh, bao gồm: số lượng và tỷ lệ các biến cố bất lợi (AE). Lập bảng theo từng loại biến cố nêu trong chỉ tiêu nghiên cứu. Mô tả chi tiết một số biến cố nặng, nghiêm trọng theo từng trường hợp cụ thể.
Phân tích tính sinh miễn dịch: nồng độ AntiS-IgG sẽ được tính toán GMC theo công thức mục 2.4.2. Còn GMFR của nồng độ AntiS-IgG tính bằng hàm lượng GMC tại ngày 42 chia cho thời điểm D0. Hiệu giá kháng thể PRNT50
trước, sau tiêm sau khi đo lường giá trị được tính toán trung bình nhân.
Các biến số định lượng được so sánh bằng phép kiểm Kruskal-Wallis.
Khảo sát mối liên quan giữa các biến số định tính bằng phép kiểm Khi bình phương. Khi không áp dụng được phép kiểm Khi bình phương (vì có trên 10% số ô trong bảng 2×2 có tần suất lý thuyết <5) hoặc khi cần tính p-values 1 chiều thì dùng phép kiểm chính xác Fisher.
2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu đã được Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của Học viện Quân y và Ban đánh giá Đạo đức trong y sinh học của Bộ Y tế (Quyết
định 5240/QĐ-BYT ngày 16/12/2020 và Quyết định 2899/QĐ-BYT ngày 11/6/2021) thông qua trước khi triển khai với sự đồng thuận của các đơn vị tham gia triển khai nghiên cứu.
Trong khi thực hiện nghiên cứu, luôn tuân thủ đúng các nguyên tắc thực hành tốt thử nghiệm lâm sàng. Việc triển khai các hoạt động đều được sự nhất trí của các cấp chính quyền, cơ quan quản lý.
Được những người tham gia nghiên cứu chấp nhận, tự nguyện tham gia vào quá trình nghiên cứu. Tất cả các đối tượng tham gia nghiên cứu đều được thông tin chi tiết cụ thể về nghiên cứu, sau đó tất cả các đối tượng đăng ký tình nguyện tham gia (có đơn tình nguyện và chữ ký xác nhận, có người làm chứng).
Tất cả các đối tượng được quyền rút khỏi nghiên cứu bất kỳ lúc nào trong quá trình triển khai nghiên cứu.