CHƯƠNG 2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu về thành phần loài mối
2.3.1.1. Phương pháp thu thập vật mẫu
Các mẫu mối thu được trong thân cây, gốc mục, cành khô, dưới thảm
mục, trong tổ,… khi bắt gặp trên tuyến điều tra. Tuyến điều tra được thiết kế theo phương pháp của Nguyễn Đức Khảm (1976) [23]. Các tuyến điều tra có thể dài ngắn khác nhau từ 1 - 3km, cắt qua các sinh cảnh: RNS, RTS, RT, trảng cây bụi,… hoặc theo các dải độ cao khác nhau.
Dụng cụ thu mẫu bao gồm cuốc, cuốc chim, xẻng, tuốc nơ vít, hộp nhựa thu bắt mối, kẹp chuyên dụng, chổi quét, bay khoét, dao, thiết bị định vị GPS, ống đựng mẫu bằng nhựa hoặc bằng thuỷ tinh và hộp nhựa đựng lọ mẫu.
Cách tiến hành thu mẫu: thu tất cả các cá thể thuộc các đẳng cấp khác nhau, trong đó đặc biệt chú ý đến mối lính. Tại mỗi vị trí thu mẫu, sử dụng hộp nhựa kích thước (30cm x 30cm x 10cm) để đựng tạm thời những mẩu gỗ bị mối hại đã lật lên hoặc để giữ mối được tách ra từ cành, thân cây mục trước khi nhặt vào lọ cố định mẫu.
Mẫu mối được định hình bằng dung dịch cồn 75%ở tại nơi thu mẫu, đánh số tạm thời, ghi chép trong sổ nhật ký thu mẫu các thông tin như: thời gian, địa điểm, độ cao, sinh cảnh, người thu mẫu. Ngoài ra, còn phải ghi thêm vào nhật ký thu mẫu một số đặc điểm khác.
Ngoài những mẫu vật thu được trong các đợt điều tra khảo sát trong 2 năm (2015-2016), chúng tôi còn được phép sử dụng các mẫu vật của các đồng nghiệp thu trước đây trong các đợt công tác triển khai hợp đồng ứng dụng và thực hiện đề tài với các địa phương tại KVNC.
Tất cả mẫu mối được đưa về phòng thí nghiệm để làm sạch, thay và bảo quản trong dung dịch cồn 75%để lưu trữ, ghi etyket và phân tích. Tất cả các công đoạn này được tiến hành ở Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình - Viện
42 Khoa học Thủy lợi Việt Nam.
2.3.1.2. Phương pháp định loại vật mẫu
Dụng cụ định loại là kính lúp hai mắt Stemi DV4 để quan sát và đo kích thước cơ thể mối. Nếu cần quan sát kỹ hơn các đặc điểm hình thái thì dùng kính hiển vi. Các dụng cụ khác là kim phân tích, kẹp nhọn, kẹp mềm. Vì mẫu mối được định hình bằng cồn nên thường cứng, khó đo kích thước nếu đặt trực tiếp lên lam kính hoặc đĩa petri, do đó để khắc phục tình trạng này, chúng tôi đã dùng giấy lọc thấm nước để đỡ mẫu, cố định các vị trí hình thái cần đo tạo thuận lợi cho quan sát và định loại.
Mẫu mối được quan sát và đo các chỉ tiêu theo hướng dẫn trong tài liệu của Roonwal (1970) [126]. Các đặc điểm hình thái chính sử dụng trong định loại được thể hiện trong hình 2.2 và 2.3.
Định loại mối theo các tài liệu của Ahmad (1958, 1965) [58, 59];
Roonwal và Chhotani (1989) [127]; Nguyễn Đức Khảm (1976) [23]; Akhta (1975) [61]; Thapa (1981) [152]; Nguyễn Tân Vương (1997) [54]; Huang Fu Sheng và cộng sự (2000) [100]; Nguyễn Văn Quảng (2003) [32]; Nguyễn Đức Khảm và cộng sự (2007) [25].
43
Hình 2.2. Cấu tạo cơ thể mối lính
(Nguồn: Nguyễn Đức Khảm, 2007)
Hình A: 1. Hàm trên; 2. Xúc biện hàm; 3. Râu; 4. Tấm lưng đốt ngực trước; 5. Tấm lưng đốt bụng; 6. Gai đuôi (Cerci); 7. Châm đuôi (Styli); 8. Thóp; 9. Môi trên. Hình B: 1. Hàm
trên; 2. Râu; 3. Cằm (Postmentum); 4. Lỗ chẩm; 5. Xúc biện hàm. Hình C: 1. Đỉnh mỡ (Point hyaline); 2. Lông môi. Hình D: 1. Xúc biện; 2. Thùy ngoài môi dưới; 3. Cằm
(Postmentum); 4. Thùy trong môi dưới. Hình E: 1. Đốt đùi; 2. Đốt ống; 3. Lá đệm
(Pulvili); 4. Vuốt; 5. Đốt bàn chân; 6. Gai ống chân.
44
Hình 2.3. Cách đo kích thước đầu mối lính
(Nguồn: Roonwal, 1989)
RR’: Chiều rộng cực đại của đầu; JJ’: Chiều dài đầu đến gốc hàm; UU’: Chiều rộng của tấm lưng ngực trước; SS’: Chiều dài cực đại của tấm lưng ngực trước; LL’: Chiều dài của hàm trái (theo trục cơ thể); MM’: Chiều dài hàm trái (thường dùng) DD’: Chiều dài
từ đỉnh răng tới đỉnh hàm; OO’: Chiều dài của cằm; QQ’: Chiều rộng cực đại của cằm;
KK’: Chiều rộng cực tiểu của cằm.
2.3.1.3. Phương pháp giải trình tự ADN gen ty thể
Để kiểm tra các mẫu mối có đặc điểm hình thái tương đối giống nhau nhưng còn một vài điểm sai khác, khó xác định chúng là cùng loài hay khác loài, chúng tôi kiểm tra bằng phương pháp phân tích định danh bằng các marker phân tử. Trong nghiên cứu này, vùng gene COII nằm trong ADN ty thể được lựa chọn
45 để nghiên cứu (bảng 2.2). Đây là vùng gene có mức độ bảo thủ rất cao giữa các giống trong cùng một loài, từ đó giúp phân biệt các loài với mức độ chính xác cao bằng chỉ thị phân tử [75]. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu cũng đã được sử dụng rộng rãi ở các nghiên cứu khác của Hayashi và cộng sự năm 2003 [95];
Simon và cộng sự năm 1994 [133] và Yeap và cộng sự năm 2007 [166].
Bảng 2.2. Cặp mồi khuếch đại vùng gene COII sử
dụng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự mồi Kích thước Tham khảo
COII-F ATACCTCGACGWTATTCAGA
≈ 1050bp
Yeap và cộng sự, 2007
[166]
COII-R GTTTAAGAGACCAGTACTTG
* Tách chiết ADN tổng số:
Các mẫu mối bảo quản trong cồn được chúng tôi sử dụng để tách chiết
ADN. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các mẫu mối được thực hiện dựa trên các công bố trước đây (Yeap và cộng sự, 2007 [166]) với một số cải tiến.
Quy trình cụ thể được mô tả như sau: Cá thể mối ngâm trong cồn được rửa 2 lần bằng nước cất, sau đó rửa lại 2 lần bằng đệm TE 1x (10mM Tris HCl pH8, 0,1mM EDTA) và thấm khụ. Cỏc mẫu này được nghiền trong 500àl dung dịch đệm Lysis (25 mM Tris HCl pH8, 50 mM Succrose, 10mM EDTA, 2% SDS) có bổ sung Protease K và ủ ở 56oC trong 3 giờ. 500àl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) được bổ sung vào hỗn hợp, trộn đều nhẹ nhàng và ly tâm 13.000
(rpm/15 phút/4oC). Dung dịch pha trên chứa DNA được hút chuyển sang ống mới và bổ sung 1 thể tích tương ứng Isopropanol và 0,1 thể tích dung dịch
CH3COONa 3M (pH 4.5) và trộn đều nhẹ nhàng. ADN được để kết tủa trong điều kiện -20oC trong vòng 30 phút, sau đó tiến hành ly tâm 13.000 (rpm/15 phỳt/4oC). ADN được rửa lại bằng 1ml cồn 75%, làm khụ và hũa lại trong 50àl
46 đệm TE. ADN được bảo quản trong điều kiện -20oC cho các thí nghiệm tiếp theo.
*Phương pháp khuếch đại vùng gene COII
Vùng gene COII được khuếch đại sử dụng cặp mồi đã được nêu ở trên.
Thành phần phản ứng được mô tả như sau:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tích
PCR buffer 10X 5àl
dNTP 10 mM 2àl
COII-F 10 (pmol/àl) 2,5àl
COII-R 10 (pmol/àl) 2,5àl
Khuụn ADN 2àl
Taq polymerase (5U/àl) 0,2àl
H2O 35,8àl
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 5 phút 1
95oC 15 giây
40
50oC 15 giây
72oC 1 phút 10 giây
72oC 5 phút 1
4oC Dừng phản ứng
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%, nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide 0,05mg/ml trong 10 phút và chụp ảnh kiểm tra dưới ánh sáng UV. Sản phẩm thu được sẽ được tinh sạch trên gel bằng cách sử
47 dụng kit GeneJET Gel extraction Kit (ThermoFisher) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mẫu ADN tinh sạch sẽ được gửi đi giải trình tự ở hãng 1stbase (Singapore).
* Phân tích mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng gene COII của các
mẫu mối thu thập được với các trình tự tham chiếu trên thế giới.
Dữ liệu về trình tự vùng gene COII của các mẫu mối thu được sau khi đọc trình tự sẽ được lắp ráp và xử lý sử dụng công cụ SeqMan của gói công cụ DNAstar. Trình tự vùng gene COII sau khi được xử lý sẽ được blast trên ngân hàng gene NCBI nhằm tìm kiếm các trình tự tương đồng ở các loài mối khác nhau. Trình tự vùng gene COII của các nhóm mối thu thập được và các trình tự tham chiếu đã được công bố trước đây sẽ được tiến hành căn trình tự sử dụng công cụ BioEdit. Cây phả hệ di truyền dựa trên phương pháp Maximum Likelyhood được xây dựng dựa trên mô hình thay thế phù hợp nhất sử dụng công cụ MegaX, mức độ tin cậy của các nhánh được tính toán dựa trên phương pháp boostrap với 1.000 lần lặp lại.
Công việc trên được thực hiện tại Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.1.4. Phương pháp phân tích độ tương đồng về thành phần loài
So sánh thành phần loài mối giữa các tỉnh trong KVNC với nhau, giữa khu hệ nghiên cứu với các vùng lân cận và giữa các sinh cảnh, dải độ cao khác nhau bằng cách sử dụng chỉ số tương đồng hay hệ số tương đồng (hệ số Bray -
Curtis) (dẫn theo Somerfield, 2008 [135]) và qua phần mềm Primer V6 dựng sơ đồ tương đồng:
Công thức: S’jk = 100 x [1 - Σn|yik - yjk|/Σ(yik + yjk)]
Trong đó: S’jk :Biểu hiện mức tương đồng;
yik : Số lượng loài k trong tập hợp mẫu i;
yjk : Số lượng loài k trong tập hợp mẫu j.
48 Mức độ tương đồng Bray - Curtis được đánh giá như sau [135]:
S’jk : 0 - 20% Gần nhau rất ít
S’jk : > 20% - 40% Gần nhau ít
S’jk : > 40% - 60% Gần nhau
S’jk : > 60% - 80% Gần nhau nhiều
S’jk : > 80% Giống nhau Ngoài ra, chúng tôi còn sử dụng phương pháp tính chỉ số tương đồng K
(Sorensen, 1948 [136]) dùng để đánh giá mức độ giống nhau về thành phần loài của khu hệ nghiên cứu với một số nước lân cận. Tính theo công thức sau:
K= 2c/(a+b) Trong đó: a: Số loài trong khu hệ A;
b: Số loài trong khu hệ B;
c: Số loài chung có trong cả 2 khu hệ A và B.
K nhận giá trị từ 0 tới 1. Trị số của K càng gần 1 thì mức độ giống nhau của các tập hợp càng lớn:
0,00 - 0,20 : Gần nhau rất ít;
> 0,20 - 0,40 : Gần nhau ít;
> 0,40 - 0,60 : Gần nhau;
> 0,60 - 0,80 : Gần nhau nhiều;
> 0,80 - 1,00 : Rất gần nhau.