PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Điều tra thành phần loài và diễn biến tỷ lệ hại của các loài ruồi đục quả hại nhãn ở một số vùng trọng điểm trồng nhãn ở phía Bắc và phía Nam.
* Xác định thành phần loài ruồi đục quả trên cây nhãn và mức độ hại của
chúng
Điều tra được thực hiện theo phương pháp TCVN 13268-4: 2021 phương pháp điều tra sinh vật gây hại (Cục Bảo vệ thực vật, 2021). Thí nghiệm được thực hiện trong 2 năm 2021, 2022
Thực hiện ở các vườn cố định có diện tích tối thiểu 2 ha, đang trong thời kỳ
khai thác. Mỗi vườn điều tra 10 điểm, mỗi điểm chọn 1 cây phân bố đều trên vườn điều tra. Cây được chọn để điều tra phải cách đường biên ít nhất 1 hàng cây. Trên mỗi cây chọn 4 hướng ở tầng giữa, mỗi hướng điều tra 2 chùm quả, chọn ngẫu nhiên 10 quả kết hợp với thu quả rụng trong phạm vi tán cây chuyển về phòng thí nghiệm theo dõi.
Thời gian điều tra định kỳ 7 ngày/lần từ khi cây bắt đầu hình thành quả tới
cuối vụ thu hoạch. Các quả nhãn rụng dưới tán cây và một số quả nhãn ở trên cây được thu thập và đưa về phòng thí nghiệm để kiểm tra. Các quả thối hỏng hoặc sắp thối hỏng sẽ được bổ ra để kiểm tra ngay, nếu phát hiện sâu non hoặc trứng của ruồi đục quả sẽ chuyển sang nuôi bằng thức ăn nhân tạo cho đến khi trưởng thành vũ hóa. Đối với các quả còn nguyên vẹn hoặc chưa có dấu hiệu rõ ràng của vết châm thì đặt vào trong hộp nhựa có nắp lưới, dưới đáy lót một lớp đá vơ mi (vermiculite), theo dõi hàng ngày đến khi quả thối hỏng thì làm như bước trên.
Chỉ tiêu theo dõi là thành phần loài ruồi và tỷ lệ hại trên quả nhãn (%).
Tỷ lệ hại trên quả nhãn được tính bằng công thức
Tỷ lệ hại (%) = Tổng số quả bị hại
x 100 Tổng số quả điều tra
Mẫu trưởng thành ruồi đục quả thu được từ ngoài đồng và từ bẫy được chuyển về phòng thí nghiệm để giám định tên khoa học của chúng. Định danh ruồi đục quả theo đặc điểm hình thái trưởng thành theo khóa phân loại tại tài liệu The Australian Handbook for the Identification of Fruit Flies Version 3.1 (The Plant Health Australia, 2018) và tiêu chuẩn quốc tế về KDTV số 27 về giám định sinh
vật gây hại- phần 29 về Bactrocera dorsalis (International Plant Ptotection
Convention, 2019).
* Xác định diễn biến số lượng trưởng thành ruồi đục quả bằng phương pháp
treo bẫy
Sử dụng thuốc dẫn dụ côn trùng T-P Nongfeng 950SL (hoạt chất Methyl Eugenol 900g/l + Naled 50g/l) hay còn gọi là bẫy Methyl Eugenol (ME) dẫn dụ trưởng thành đực. Cuộn bông (loại bông thấm nước) thật chặt tròn kiểu dạng đầu điếu thuốc lá (bấc), dài 4-5cm, đường kính 1cm. Treo miếng bông vào trong bẫy.
Lấy kim tiêm để bơm mồi (2-3ml/ 1 lần). Bẫy treo dưới tán cây, tránh ánh sáng trực xạ, cách mặt đất 1,5 - 2 m với số lượng 15 bẫy/vườn. Thời điểm đặt bẫy từ khi bắt đầu hình thành quả cho đến khi thu hoạch xong. Thời gian thu bẫy là 7 ngày/lần.
Thí nghiệm được thực hiện năm 2021 tại Hải Dương và 2022 tại Cần Thơ.
Chỉ tiêu theo dõi: số lượng trưởng thành vào bẫy mỗi lần thu.
* Định danh ruồi đục quả bằng phương pháp giải trình tự gen - Số lượng và nguồn gốc mẫu:
Các mẫu ruồi đục quả được thu tại vườn nhãn bằng phương pháp thu bẫy ở các tỉnh Tây Ninh, Cần Thơ, Hải Dương, Sơn La (đối với B.dorsalis) và Hưng
Yên, Cần Thơ, Tây Ninh, Hải Dương ( đối với B. correcta). Mỗi điểm thu 3 mẫu cá thể ruồi đục quả để chiết tách DNA.
- Chiết DNA tổng số
DNA tổng số được chiết tách theo phương pháp chiết tách cá thể. Mẫu ruồi đục quả thu được tại từng địa điểm được dùng để chiết DNA. DNA tổng số thu được sẽ dùng cho phản ứng PCR. Phương pháp chiết nhanh củaWang & cs (1993) được áp dụng để chiết tách DNA tổng số. Một cá thể ruồi đục quả trưởng thành cái được nghiền trong 100 μl dung dịch NaOH 0,5 M trong ống bằng chày nhựa (Kontes™ Pellet Pestle). 5 μl dịch sau nghiền được chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml có chứa 100 μl đệm Tris 100 mM, pH 8 và được dùng làm khuôn DNA cho phản ứng PCR.
- Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện bằng kít Phusion® High-Fidelity PCR
Polymerase, 3 μl dịch DNA và 21,5 μl dH2O. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR gồm LCO1490 (5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) và HCO2198 (5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’) (Folmer &
cs., 1994). Cặp mồi này được chọn vì chúng sẽ nhân một đoạn 658 bp, được gọi là đoạn Folmer, của gen COI trên ty thể côn trùng.
Điều kiện phản ứng PCR như sau: 94℃ (1 phút); 35 chu trình phản ứng:
92℃ (30 giây), 50℃ (30 giây), 72℃ (45 giây); kết thúc ở 72℃ (3 phút). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% chứa 0,5 mg/ml Ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE (Tris Acetic acid EDTA) bằng hệ thống điện di Mupid-exU Mini System (Helixxtec) với hiệu điện thế 100 V chạy trong 30 phút.
- Giải trình tự và phân tích trình tự
Sau điện di, sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose dùng bộ kít tinh chiết Expin Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology) theo quy trình của nhà sản xuất.
Sản phẩm DNA tinh sạch được kiểm tra hàm lượng bằng điện di agarose. Sản phẩm DNA tinh chiết được gửi đi giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều tại Viện Công nghệ sinh học.
Trình tự đoạn DNA mã vạch của các mẫu đọc thành công được sử dụng để tìm kiếm trình tự tương đồng trên GenBank bằng tìm kiếm trực tuyến BLAST tại NCBI (National Center for Biotechnology Information GenBank). Trình tự DNA
của ruồi đục quả B. dorsalis và B. correcta được lấy từ cơ sở dữ liệu NCBI
(National Center for Biotechnology Information GenBank). Căn trình tự đa chuỗi được thực hiện với phần mềm ClustalW (Thompson & cs, 1994). Trình tự đoạn gen COI được so sánh sắp xếp thẳng hàng bằng ClustalW. Cây phả hệ của các mẫu được xây dựng bằng phần mềm MEGAX (Tamura & cs, 2013).
3.2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài B. dorsalis và B. correcta trên các loại thức ăn khác nhau
Nghiên cứu về các chỉ tiêu sinh học để dựng bảng sống của loài B. dorsalis và B. correcta được thực hiện bằng cách áp dụng có cải tiến phương pháp của Waqar & cs. (2018b), sử dụng tủ định ôn để duy trì điều kiện nhiệt độ 28±0,5℃
với độ ẩm 70 – 80%, thời gian chiếu sáng: tối (12:12 giờ). Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh học của ruồi đục quả B. dorsalis và B. correcta trên các giống nhãn sử dụng thức ăn là phần thịt quả của 5 giống nhãn khác nhau; trên các loại
thức ăn nhân tạo sử dụng thức ăn là 4 loại thức ăn TA1, TA2, TA3 và TA4 ở mục 3.2.1.
- Pha trứng: thu trứng trong vòng 12 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm, tổng lượng trứng sử dụng là 200 trứng/công thức thức ăn. Dụng cụ thu trứng là các hộp nhựa hình trụ (11x4cm) được đục lỗ đường kính 1mm bên cạnh cho nước cam vào
hộp thu trứng, lắc đều cho dung dịch nước cam bám vào thành hộp để dẫn dụ ruồi đẻ trứng (Phạm Thị Mỹ Nhan & cs., 2016). Dùng bút lông mềm chuyển trứng vào các đĩa petri nhựa kích thước đường kính x chiều cao 6x1,5cm (1 trứng/1 đĩa petri), nắp đĩa được đục các lỗ nhỏ để thoáng khí. Đối với thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh học trên thức ăn là 5 giống nhãn khá nhau thì cắt cùi nhãn thành các miếng nhỏ (1 quả cắt làm 2 miếng) đặt vào trong các đĩa petri dùng bút lông mềm chuyển 1 quả trứng lên miếng cùi nhãn; cùi nhãn được thay hàng ngày Theo dõi số lượng trứng nở mỗi ngày.
- Pha sâu non: sâu non được nuôi trong các đĩa petri và cho ăn bằng thức ăn mục tiêu của thí nghiệm, thay mới thức ăn theo chu kỳ hai ngày/lần. Theo dõi hàng ngày và ghi nhận thời gian phát dục của sâu non các tuổi.
- Pha nhộng: tại ngày đầu tiên khi sâu non hóa nhộng, dùng bút lông mềm chuyển nhộng sang các hộp nhỏ lót đá vermiculite, theo dõi hàng ngày đến khi vũ hóa.
- Pha trưởng thành: việc ghép cặp đực cái được thực hiện ngay sau khi trưởng thành vũ hóa và duy trì tình trạng ghép cặp này đến khi trưởng thành bị chết hết.
Mỗi cặp trưởng thành ruồi đực – cái được nuôi trong một hộp nhựa kích thước18x16x16 cm và được nuôi bằng thức ăn bổ sung gồm men khô Yeast Hydrolysate Enzymatic và đường trộn theo tỷ lệ 1:4 (Fanson & Taylor, 2012), góc hộp để miếng bông tẩm nước để cung cấp nước cho ruồi đục quả và dùng hộp nhựa hình trụ có đục lỗ nhỏ ở xung quanh với nước cam để thu trứng. Theo dõi một lần mỗi ngày vào cùng một khoảng thời gian để xác định tình thời gian sống của trưởng thành và số lượng trứng đẻ mỗi ngày.
- Đo kích thước: trứng, cá thể sâu non ruồi đục quả ở mỗi tuổi, nhộng và trưởng thành đực cũng như trưởng thành cái được chụp dưới kính hiển vi soi nổi và đo kích thước chiều dài và chiều rộng bằng phần mềm Axiovision ver. 4.8. Số lượng mẫu đo là 20 mẫu.
- Phương pháp tính sức tăng quần thể: Tỷ lệ tăng tự nhiên (rm) được tính bằng công thức của Birch (1948):
∑ 𝑙𝑥𝑚𝑥𝑒−𝑟𝑚∗𝑥 = 1
trong đó x là ngày tuổi của cá thể cái (ngày), lx là tỷ lệ sống sót của cá thể cái tại ngày tuổi x và mx là số lượng cá thể cái được ruồi cái sinh ra tại ngày tuổi x.
Phương pháp Jackknife của Meyer & cs. (1986) và Hulting & cs. (1990) được sử dụng để tính sai số chuẩn của giá trị rm.
Các chỉ tiêu khác của sức tăng quần thể được tính theo Maia & cs. (2000) như hệ số nhân của một thế hệ (R0) chỉ số lượng cá thể cái được sinh ra bởi một ruồi cái (con cái/ruồi cái)
R0= ∑ lxmx
hay thời gian 1 thế hệ (T) là khoảng thời gian cần thiết để số lượng quần thể tăng Ro lần (ngày)
T =lnRo rm
Thời gian nhân đôi quần thể (DT): DT = ln(2)/rm
3.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu sự ưa thích của ruồi đục quả với các giống nhãn khác nhau
Quả nhãn của cả 5 giống (Hương chi, Miền thiết, T2, Ido và Tiêu da bò) được thu hoạch từ các cây nhãn đã chọn trước, đảm bảo không phun thuốc BVTV trong 15 ngày trước khi thu hoạch, có trùm lưới (kích thước mắt lưới 1,6mm) để ngăn ngừa khả năng bị ruồi đục quả gây hại. Kiểm tra vết châm trên quả trước khi đưa vào thí nghiệm để đảm bảo chắc chắn quả nhãn không có RĐQ.
Trước khi thực hiện thí nghiệm, tiến hành đo độ brix, hàm lượng nước, đường kính quả, độ dày cùi, độ dày vỏ, cân trọng lượng. Số lần nhắc lại/giống là
30 lần, mỗi lần 1 quả. Điều kiện tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng (26-28℃, ẩm độ 75-80%). Thí nghiệm được tiến hành với 2 loài B. dorsalis và B. correcta.
* Thí nghiệm không có sự lựa chọn (no choice experiment)
Thực hiện theo phương pháp của Waqar & cs. (2018a). Treo một quả
nhãn/giống vào lồng nhựa trong kích thước 30 x 30 x 30 cm (5 giống nhãn tương ứng với 5 lồng), có khoét lỗ kích thước 7x7x7 để đưa quả và RĐQ vào lồng, lỗ được bịt bằng lưới mắt cáo kích thước 1,6mm quả được treo chính giữa lồng. Thả
10 cá thể trưởng thành cái của ruồi đục quả (loài B. dorsalis hoặc B. correcta tùy thuộc vào từng thí nghiệm) đã vũ hóa được 20-22 ngày vào mỗi lồng. Theo dõi trong vòng 10 giờ đồng hồ (7:00 – 17:00) để đếm số lần ruồi đậu lên quả, số lần châm vào quả nhãn. Mỗi quả theo dõi liên tục 10 phút/giờ.
Thí nghiệm được thực hiện ở 2 điều kiện có bổ sung thức ăn cho trưởng thành và không bổ sung thức ăn cho trưởng thành. Thức ăn cho trưởng thành là thức ăn bổ sung gồm men khô Yeast Hydrolysate Enzymatic và đường trộn theo tỷ lệ 1:4 (Fanson & Taylor, 2012)
Vào cuối ngày, thu quả nhãn ở các công thức đặt vào các hộp riêng rẽ có lót vermiculite hoặc cát sạch, để trong 7 ngày cho đến khi sâu non hóa nhộng. Đếm số nhộng và số sâu non chưa hóa nhộng (nếu còn).
Thí nghiệm này được bố trí lặp lại 6 lần.
* Thí nghiệm có sự lựa chọn (choice experiment)
- Đối với các giống nhãn ở phía Bắc: thực hiện so sánh sự ưa thích của RĐQ với 3 giống nhãn Hương chi, Miền thiết và T2.
Mỗi giống nhãn chọn một quả, treo cả 3 quả của 3 giống nhãn với khoảng cách đều nhau vào lồng kích thước 40 x 30 x 30 cm, có khoét lỗ kích thước 7x7x7 để đưa quả và RĐQ vào lồng, lỗ được bịt bằng lưới mắt cáo kích thước 1,6mm.
Thả 10 cá thể trưởng thành của RĐQ đã vũ hóa được 20-22 ngày vào mỗi lồng và quan sát.
- Đối với các giống nhãn phía Nam: so sánh sự ưa thích của RĐQ với 2 giống Ido và Tiêu da bò.
Mỗi giống nhãn chọn một quả, treo cả 2 quả của 2 giống nhãn vào lồng kích thước 40 x 30 x 30 cm với khoảng cách đều nhau. Thả 10 cá thể trưởng thành của RĐQ đã vũ hóa được 20-22 ngày vào mỗi lồng và quan sát.
Điều kiện thí nghiệm, cách thức theo dõi thực hiện giống như đối với thí nghiệm lây nhiễm không có sự lựa chọn.
* Thí nghiệm xác định sự ưa thích trong điều kiện có vết châm
Thực hiện trên giống nhãn Hương chi với 2 công thức (1) quả không có vết
Vết châm cơ giới được tạo ra bằng cách châm kim cắm côn trùng số 000 (tương đương đường kính 0,25 mm) lên thịt quả. Thời gian châm trước khi tiến hành thí nghiệm là 1 giờ.
Điều kiện thí nghiệm, cách thức theo dõi thực hiện giống như đối với thí nghiệm lây nhiễm không có sự lựa chọn và có sự lựa chọn. Đối tượng lựa chọn là có vết châm cơ giới hoặc không có vết châm.
3.2.2.4. Phương pháp nghiên các thông số xử lý nhiệt lạnh diệt trừ ruồi đục quả B. dorsalis trên quả nhãn tươi
* Quả nhãn thí nghiệm
Sử dụng giống nhãn Ido (Edor) đang được trồng phổ biến ở phía Nam và là loại nhãn chính dự kiến xuất khẩu. Quả được chọn từ các cây định sẵn tại vườn trồng ở tỉnh Bến Tre, phủ màng lưới bảo vệ để đảm bảo không nhiễm sinh vật gây
hại và không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Quả nhãn sử dụng trong thí nghiệm được hái ở thời kỳ thu hoạch, giữ nguyên chùm cành và lá, bảo quản ở nhiệt độ mát và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 6-8 giờ sau thu hoạch để đảm bảo chất lượng.
Quả nhãn được lây nhiễm ruồi đục quả Phương đông trước khi xử lý nhiệt lạnh. Mỗi quả nhãn thí nghiệm được cấy 20 trứng. Dùng bút lông mềm đếm 20 quả trứng đặt lên miếng lưới đen, cắt một cửa sổ kích thước 1 × 1 cm trên vỏ quả, quét trứng từ miếng lưới đen vào phần thịt quả, đậy vỏ quả và dùng băng keo dán hờ đảm bảo tạo sự thông thoáng cho sâu non phát triển. Với pha sâu non tuổi 1, tuổi 2 sẽ được tính lần lượt sau 45,37 ±0,61 giờ và 73,50 ±0,46 giờ từ khi cấy trứng. Riêng sâu non tuổi 3, cắt một hình vuông kích thước khoảng 1 × 1 cm trên quả nhãn, dùng bút lông mềm đặt 15 cá thể sâu non tuổi 3 được nuôi bằng thức ăn nhân tạo vào, cố định bằng băng keo và tạo lỗ hở cho sâu non hô hấp.
* Phương pháp xác định giai đoạn chống chịu nhiệt lạnh nhất của ruồi đục quả B. dorsalis
Thí nghiệm được thực hiện đối với 4 giai đoạn phát dục của ruồi đục quả Phương đông B. dorsalis: trứng, sâu non tuổi 1, sâu non tuổi 2 và sâu non tuổi 3;
thời gian duy trì xử lý nhiệt lạnh được áp dụng với 9 công thức là xử lý trong 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 13 ngày, 15 ngày, 17 ngày và 20 ngày.
Nhiệt độ xử lý được lựa chọn là 1 - 1,5℃ với ẩm độ 60 - 75%, thời gian xử lý được tính từ lúc nhiệt độ tâm quả của 2/3 cảm biến nhiệt đạt 1 - 1,5℃. Số quả nhãn ở
mỗi công thức của 1 lần lặp lại là 30 quả/giai đoạn phát triển/ thời gian xử lý nhiệt lạnh. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Sau thời gian xử lý của mỗi công thức thí nghiệm, quả được lấy ra và bảo quản ở nhiệt độ 28℃. Thực hiện kiểm tra số lượng cá thể sống sót sau khi lấy ra khỏi buồng xử lý theo thứ tự như sau: đối với công thức cấy sâu non tuổi 3 vào quả kiểm tra sau 01 ngày, đối với công thức sâu non tuổi 2 kiểm tra sau 02 ngày, đối với công thức sâu non tuổi 1 kiểm tra sau 03 ngày, đối với công thức trứng kiểm tra sau 04 ngày. Mục đích để cho B. dorsalis có khả năng phục hồi và phát triển đến giai đoạn có thể dễ phát hiện.
Công thức đối chứng cũng được chuẩn bị tương tự như các công thức thí nghiệm và được bảo quản ở nhiệt độ 28℃, thực hiện kiểm tra theo thứ tự tương tự các công thức thí nghiệm.
Thí nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của Nhóm nghiên cứu về các biện pháp KDTV của Công ước quốc tế về Bảo vệ thực vật - IPPC (PMRG, 2019) và Yamamoto & cs. (2017).
* Phương pháp xác định thời gian duy trì xử lý nhiệt lạnh phù hợp đối với loài B. dorsalis
Kết quả ở xác định giai đoạn chống chịu nhiệt lạnh nhất đã xác nhận sâu non tuổi 3 của ruồi đục quả Phương đông chống chịu tốt nhất với nhiệt độ từ 1 đến 1,5℃. Vì thế sâu non tuổi 3 được lựa chọn để thực hiện thí nghiệm nghiên cứu thông số xử lý nhiệt lạnh.
Quả nhãn thí nghiệm được chuẩn bị tương tự như ở thí nghiệm 1. Quả nhãn đã lây nhiễm được đặt trong buồng xử lý nhiệt lạnh ở nhiệt độ từ 1 - 1,5℃ với ẩm độ 60 - 75% và theo dõi ở 4 công thức thời gian xử lý nhiệt lạnh 7 ngày, 9 ngày, 11 ngày và 13 ngày. Thời gian xử lý được tính từ lúc 2/3 cảm biến nhiệt đạt 1 - 1,5℃.
Số quả nhãn ở mỗi công thức 250 quả (chia thành 5 hộp, mỗi hộp 50 quả), mỗi quả được cấy 15 cá thể sâu non tuổi 3. Thí nghiệm được thực hiện 2 lần riêng biệt.
Sau thời gian xử lý của mỗi công thức thí nghiệm, quả được lấy ra và bảo quản ở nhiệt độ 28℃. Thực hiện kiểm tra số lượng cá thể sống sót sau 1 ngày