PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1.4. Kết quả định danh ruồi đục quả bằng phương pháp sinh học phân tử
4.1.4.1. Kết quả tìm kiếm trình tự đoạn DNA mã vạch của ruồi đục quả gây hại trên nhãn tại Việt Nam
Đến nay, các nghiên cứu về thành phần loài ruồi đục quả tại Việt Nam
đời, hình thái của ruồi đục quả đã có những thay đổi nhất định có thể làm ảnh hưởng tới độ chính xác của phương pháp giám định bằng đặc điểm hinh thái.
Trong khi đó, biện pháp giải trình tự DNA cung cấp thông tin chính xác về cấu trúc di truyền của ruồi đục quả, cho phép phân biệt các loài có hình thái tương
tự nhau hoặc bị mất đặc điểm hình thái đặc thù. Chính vì vậy, nghiên cứu này đã bổ sung các kết quả định danh ruồi đục quả bằng phương pháp sinh học phân tử để khẳng định lại một cách chính xác kết quả điều tra ở ngoài đồng.
Trình tự DNA của đoạn gen mã vạch trên gen COI của các mẫu ruồi đục
quả hại trên quả nhãn và trưởng thành ruồi vào bẫy dẫn dụ Me của 2 loài ruồi đục quả phổ biến B. dorsalis và B. correcta thu thập tại các tỉnh là được sử dụng để tìm kiếm trình tự tương đồng bằng tìm kiếm Blast trên cơ sở dữ liệu genbank trên NCBI. Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng và mức đồng nhất trình tự được trình bày tại bảng 4.5.
Kết quả tại bảng 4.5 cho thấy các mẫu ruồi đục quả hại trên quả nhãn và trong vườn nhãn thu thập tại một số tỉnh của Việt Nam thuộc hai loài Bactrocera
correcta và Bactrocera dorsalis. Các mẫu ruồi đục quả B. correcta và B. dorsalis
đều có mức đồng nhất trình tự cao trên 98% với các mẫu ruồi đục quả cùng loài thu thập tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Bangladesh, Lao, Campuchia, Malaysia, Đài Loan và Sri Lanka.
Bảng 4.5. Trình tự tương đồng của đoạn gen COI các mẫu ruồi đục quả hại nhãn năm 2021-2022 tìm kiếm bằng phương pháp BLAST trên NCBI
Tên mẫu trình tự COI Loài Quốc gia
Phần trăm đoạn so sánh (%)
Mức đồng nhất trình
tự (%)
Mã GenBank
HY3.1.2 Bactrocera
correcta
Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Sri Lanka Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc
100 100 100 100 100 100 100
99,53 99,53 99,06 99,68 98,90 98,90 98,90
MN016978 MN016970 MN016969 JQ692753 KJ753908 KJ753906 MW410933
Tên mẫu trình tự COI Loài Quốc gia
Phần trăm đoạn so sánh (%)
Mức đồng nhất trình
tự (%)
Mã GenBank
CT2.1.2 Bactrocera
correcta
Ấn Độ Ấn Độ Campuchia Sri Lanka Sri Lanka Trung Quốc Trung Quốc
100 100 100 100 100 100 100
99,53 99,21 99,84 99,84 99,36 98,59 99,82
MN016978 MN016970 MF970795 JX297524 JQ692753 KJ753908 DQ116265
TN1.2 Bactrocera
correcta
Ấn Độ Ấn Độ Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Thái Lan Bangladesh
100 100 100 100 100 100 100
100 100 99,84 99,84 99,53 99,84 99,84
MN016976 MN016969 KJ753905 MW410933
KJ753908 MW067302
MH988690
HD2 Bactrocera
correcta
Trung Quốc
Trung Quốc Ấn Độ Ấn Độ Thái Lan Bangladesh Trung Quốc
100 100 100 100 100 100 100
100 100 99,84 99,84 100 99,68
100
KJ753905 MW410933
MN016974 MN016969 MW067302 MH988690 JX297525
CT2.1.1 Bactrocera
dosalis
Ấn Độ Ấn Độ Thái Lan Thái Lan Trung Quốc Malaysia Trung Quốc Thái Lan
100 100 100 100 100 100 100 100
99,84 99,69 99,69 99,69 99,69 99,69 99,69 99,69
ON725008 MN016995 MH707334 MH187232 MW410926 MG689904 MG689670 MG689345
TN2.1 Bactrocera
dosalis
Ấn Độ Trung Quốc Thái Lan Trung Quốc Lào
100 100 100 100 100
100 99,84 99,84 99,84 99,69
KX259497 MG689929 MG689335 MG688643 MG689178
Tên mẫu trình tự COI Loài Quốc gia
Phần trăm đoạn so sánh (%)
Mức đồng nhất trình
tự (%)
Mã GenBank
SL1.2 Bactrocera
dosalis
Ấn Độ Trung Quốc Thái Lan Thái Lan Trung Quốc Trung Quốc Bangladesh
100 100 100 100 100 100 100
99,84 99,84 99,84 99,84 99,84 99,84 99,84
MN016995 MN016991 MH707334 MH187232 KJ753919 OM319572
OL693247
HD1 Bactrocera
dosalis
Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Bangladesh Trung Quốc
Trung Quốc Đài Loan
100 100 100 100 100 100 100
99,84 99,84 99,84 99,69 99,69 99,69 99,69
OR118153 KF998624 KF318554 MG688931 MG688831 MG687735 OR118087
4.1.4.2. Phân tích trình tự và cây phả hệ của ruồi đục quả gây hại trên nhãn năm 2022 tại Việt Nam
Trình tự của đoạn gen COI của 4 mẫu ruồi đục quả B. correcta và 4 mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu được trong vườn nhãn và trên quả nhãn tại Việt Nam và các mẫu ruồi đục quả cùng loài thu thập tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan,
Bangladesh, Lào, Campuchia, Malaysia, Đài Loan và Sri Lanka trên cơ sở dữ liệu genbank được so sánh mức độ tương đồng bằng phương pháp căn trình tự đa chuỗi ClustalW.
Kết quả ở bảng 4.6 cho thấy tỷ lệ tương đồng cao nhất là 100% giữa mẫu ruồi đục quả B. correcta thu tai Hải Dương với trình tự MW410933 thu tại
Trung Quốc (638 bp). Tỷ lệ tương đồng trình tự DNA của các mẫu thấp nhất 97,723% khi so sánh trình tự DNA của mẫu B. correcta thu tại Cần Thơ với
trình tự MW067302 thu tại Thái Lan (571 bp). Ngoài ra, trình tự DNA trên đoạn COI của các mẫu ruồi đục quả B. correcta thu thập tại Hưng Yên, Cần Thơ, Tây Ninh và Hải Dương có tỷ lệ tương đồng về trình tự đều đạt trên 98,5% đến 99,686%.
Bảng 4.6. So sánh tỷ lệ tương đồng trên đoạn gen COI của Bactrocera
correcta hại nhãn năm 2021-2022 tại Việt Nam và các trình tự trên cơ sở dữ
liệu Genbank
Tên mẫu
Tỷ lệ tương đồng trên đoạn gen COI HY3.1.2
Hưng Yên (637 bp)
CT2.1.2 Cần Thơ
(637 bp)
TN1.2 Tây Ninh (637 bp)
HD2 Hải Dương
(637 bp)
HY3.1.2
Hưng Yên - 99,686 99,058 98,901
CT2.1.2
Cần Thơ - - 98,744 98,587
TN1.2
Tây Ninh - - - 99,843
MN016978
Ấn Độ (638 bp) 99,529 99,529 98,901 98,744
MN016970 Ấn Độ (636 bp) 99,528 99,214 99,214 99,057
MH988690
Bangladesh (628 bp) 98,885 98,567 99,841 99,682
MF970795
Campuchia (622 bp) 99,035 99,357 98,071 97,910
MW067302
Thái Lan (571 bp) 98,074 97,723 98,949 99,124
KJ753908
Trung Quốc (637 bp) 98,901 98,587 99,529 99,372
MW410933
Trung Quốc (638 bp) 98,901 98,587 99,843 100
JQ692753
Sri Lanka (624 bp) 99,679 99,359 99,359 99,199
Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy tỷ lệ tương đồng cao nhất là 100% giữa mẫu
B. dorsalis thu tại Tây Ninh với mẫu KX259497 thu tại Ấn Độ. Tỷ lệ tương đồng
của các mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu thập tại Cần Thơ, Tây Ninh, Sơn La và Hải Dương có tỷ lệ tương đồng về trình tự đều đạt trên 98,9% đến 99,5%.
Bảng 4.7. So sánh tỷ lệ tương đồng trên đoạn gen COI của B. dorsalis hại nhãn năm 2021-2022 tại Việt Nam và các trình tự trên cơ sở dữ liệu
Genbank
Tên mẫu
Tỷ lệ tương đồng trên đoạn gen COI CT2.1.1
Cần Thơ (637 bp)
TN2.1 Tây Ninh
(637 bp)
SL2.1 Sơn La (637 bp)
HD1 Hải Dương
(637 bp)
CT2.1.1
Cần Thơ 99,215 99,529 99,058
TN2.1
Tây Ninh 99,372 98,901
SL2.1
Sơn La 99,529
ON725008
Ấn Độ (637 bp) 99,529 99,058 99,372 98,901
KX259497
Ấn Độ (637 bp) 99,215 100 99,372 98,901
OL693247
Bangladesh (637 bp) 99, 372 99,215 99,843 99,372
MG688931
Bangladesh (637 bp) 98,744 98,587 99,215 99,3721
OR118087
Đài Loan (637 bp) 98,744 98,587 99,215 99,372
MG689178
Lào (637 bp) 99,215 99,372 99,372 98,901
MG689904 Malaysia
(637 bp) 99,372 99,215 99,529 99,058
MH707334
Thái Lan (637 bp) 99,686 99,529 99,843 99,372
KJ753919
Trung Quốc (637 bp) 99,686 99,529 99,843 99,372
MW410926
Trung Quốc (637 bp) 99,686 99,529 99,843 99,372
Hình 4.1. Cây phả hệ dựa trên trình tự đoạn DNA mã vạch trên gen COI
của 4 mẫu ruồi đục quả Bactrocera correcta tại Việt Nam và 8 trình tự COI tương đồng của loài B. correcta và 01 trình tự của loài B. dorsalis, 01 trình tự
loài B. latifrons trên cơ sở dữ liệu genbank.
Ghi chú: Trình tự COI tương đồng của loài Bactrocera correcta (JQ692753, KJ753908, MF970795, MH988690, MN016970, MN016978, MW067302, MW410933); loài B. dorsalis (KJ753919) và loài B.
latifrons (MN119924 ) trên cơ sở dữ liệu genbank NCBI. Các mẫu được căn trình tự đa chuỗi bằng phần
mềm ClustalW. Cây được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood method and mô hình Tamura- Nei. Cây ban đầu dùng cho tìm kiếm heuristic được thu được bằng cách áp dụng phương pháp Neighbor- Joining cho ma trận khoảng cách cặp đôi, ước lượng bằng mô hình Tamura-Nei. Cây được vẽ theo tỷ lệ,
Tại Hình 4.1, cây phả hệ của 4 mẫu ruồi đục quả B. correcta thu thập tại Hưng Yên, Cần Thơ, Tây Ninh và Hải Dương và các trình tự của cùng loài ruồi đục quả B. correcta thu thập từ các nước và 01 trình tự của loài B. dorsalis, 01 trình tự COI của loài ruồi đục quả B. latifrons (MN119924- Thái Lan) là hai loài ngoài nhóm trên Genbank (Hình 4.1). Phân tích phả hệ cho thấy 4 mẫu ruồi đục quả trên đều là
loài B. correcta với giá trị boostrap tin cậy (100%). Mẫu ruồi đục quả B. correcta thu thập tại Hưng Yên, Cần Thơ có khoảng cách di tuyền gần với mẫu DNA của loài B. correcta thu thập tại Campuchia và Ấn Độ. Mẫu ruồi đục quả B. correcta thu tại Tây Ninh có khoảng cách di tuyền gần với mẫu DNA của loài B. correcta thu thập tại Bangladesh. Mẫu ruồi đục quả B. correcta thu tại Hải Dương có khoảng cách di tuyền gần với mẫu DNA của loài B. correcta thu thập tại Trung Quốc và Thái Lan.
Tại Hình 4.2, cây phả hệ của 4 mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu thập tại Cần Thơ, Tây Ninh, Sơn La và Hải Dương và 10 trình tự của cùng loài ruồi đục quả
B. dorsalis thu thập từ các nước và 01 trình tự của loài B. correcta, 01 trình tự COI của loài ruồi đục quả B. latifrons (MN119924- Thái Lan) là hai loài ngoài nhóm trên Genbank (Hình 4.2). Phân tích phả hệ cho thấy 4 mẫu ruồi đục quả trên đều là loài
B. dorsalis với giá trị boostrap tin cậy (100%). Mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu
thập tại Cần Thơ có khoảng cách di tuyền gần với mẫu DNA của loài B. dorsalis thu thập tại Ấn Độ và Malaysia. Mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu tại Tây Ninh có khoảng cách di truyền gần với mẫu DNA của loài B. dorsalis thu thập tại Ấn Độ và Lào. Mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu tại Sơn La có khoảng cách di tuyền gần
với mẫu DNA của loài B. dorsalis thu thập tại Trung Quốc và Thái Lan. Mẫu ruồi đục quả B. dorsalis thu tại Hải Dương có khoảng cách di tuyền gần với mẫu DNA của loài B. dorsalis thu thập tại Đài Loan và Bangladesh.
Hình 4.2. Cây phả hệ dựa trên trình tự đoạn DNA mã vạch trên gen COI của 4 mẫu ruồi đục quả B. dorsalis tại Việt Nam (CT2.1.1, TN2.1, SL2.1, HD1) và 10 trình tự COI tương đồng của loài B. dorsalis và 01 trình tự của loài B. correcta, 01 trình tự của loài B. latifrons trên cơ sở dữ liệu genbank.
Ghi chú: Trình tự COI tương đồng của loài B. dorsalis (MH707334, KJ753919, MW410926, KX259497, OL693247, ON725008, MG689178, MG689904, MG688931, OR118087); loài B. correcta (MF970795) và loài B. latifrons (MN119924 ) trên cơ sở dữ liệu genbank NCBI. Các mẫu được căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm ClustalW. Cây được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood method and mô hình Tamura-Nei (Tamura & Nei, 1993). Cây ban đầu dùng cho tìm kiếm heuristic được thu được bằng cách áp dụng phương pháp Neighbor-Joining cho ma trận khoảng cách cặp đôi, ước lượng bằng mô hình
Kết quả phân tích phả hệ này đồng nhất với kết quả tìm kiếm Blast và phân tích sắp xếp thẳng hàng trình tự CLUSTALW ở trên. Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi kết luận các mẫu ruồi đục quả thu thu thập trên vườn nhãn tại Việt Nam gồm hai loài B. correcta và B. dorsalis, họ Tephritidae, bộ Hai cánh.
Có thể thấy ruồi đục quả B. dorsalis xuất hiện trong vườn ở tất cả các giai đoạn phát triển của quả nhãn, nhưng chỉ gây hại quả nhãn ở giai đoạn chuẩn bị thu hoạch và thu hoạch. Trong khi đó, các loài B. correcta và B. umbrosa xuất hiện trên vườn nhãn nhưng chưa phát hiện gây hại quả nhãn. Đây là một trong những căn cứ quan trọng để có thể xác định nhãn không phải là ký chủ của các loài này.