III. Nội dung nghiên cƣ́u
3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng
Trƣớc khi tiến hành chuyển cấu trúc vector chuyển gen đƣợc thiết kế vào cây đậu tƣơng, chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc vector pBI101::rd29A::gus vào cây đậu tƣơng để kiểm tra hoat động của promoter rd29A và tỉ lệ chuyển gen ở cây đậu tƣơng DT84. Mỗi một cấu trúc vector và promoter sƣ̉ dụng trong thiết kế vector chuyển gen đều ản h hƣởng đến tỉ lệ chuyển gen . Một số nghiên cƣ́u đã chỉ ra rằ ng khi sƣ̉ dụng promoter và vector không phù hợp thì gây ra sƣ̣ biểu hiện gen trong điều kiện bình thƣờng và gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của cây chuyển gen , thƣờng làm biến đổi kiểu hình gây lùn cây và làm chậ m quá trình sinh trƣởng . Vì vậy, cần lƣ̣a chọn các cấu trúc vector
54
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
và promoter điều khiển gen phù hợp để hạn chế tối đa ảnh hƣởng đến cây chuyển gen trong điều kiện bình thƣờng.
Giống đậu tƣơng tiến hành nghiên cƣ́u là giống DT84 đƣợc chuyển gen thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens có chứa vector pBI101::rd29A::gus theo quy trình đã đƣợc tối ƣu hóa theo tác giả Nguyễn Thị Thúy Hƣờng [9] và Nguyễn Thu Hiền [5]. Kết quả thu đƣợc chúng tôi trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót của các mô đậu tƣơng qua các giai đoạn chọn lọc
Lô thí nghiệm
Số mẫu biến nạp
Số mẫu tạo đa chồi
Số chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Số cây dƣơng tính với PCR 1 190 120 11 7 2 - 2 250 172 30 22 7 - 3 290 142 40 27 10 1 4 287 175 57 30 13 - 5 295 201 20 19 9 1 6 298 108 17 16 11 - 7 300 189 38 23 17 1 8 270 200 33 14 15 1 Tổng 2180 1370 246 158 82 4
Số lƣợng mẫu biến nạp là 2180 trong đó có 1370 mẫu tạo đa chồi, chiếm tỉ lệ 62,84 %. Tƣ̀ các cụm chồi này thu đƣợc 246 chồi kéo dà i ở các giai đoạn khác nhau ; có thể ở giai đoạn SIM0, SIMkana100, hay SEM ; chiếm tỉ lệ 11,28 %. Các chồi mọc cao đến một kích thƣớc nhất định khảng 5-7cm thì đƣợc c ắt chuyển sang môi trƣờng ra rễ có chứa kháng sinh cefotaxim 250mg/l. Trong môi trƣờng ra rễ RM , các chồi ra rễ là 158chiếm tỉ lệ 7,25 %. Chất lƣợng rễ ở các chồi là khác nhau , có một số chồi không ra rễ . Chọn lọc các chồi ra rễ tạo cây hoàn chỉnh , tiến hành cho ra trấu : cát, trong giá thể trấu : cát có 82
55
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
cây sống sót . Sau đó tiếp tục cho ra đất trồng . Các giai đoạn phát triển cụ thể đƣợc trình bày trong hình 3.18
Môi trƣờng SIMo Môi trƣờng SIMo sau 2 tuần
Môi trƣờng SIMkana100 Môi trƣờng SEM
Môi trƣờng ra rễ RM
56
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Giá thể TN1
Hình 3.18. Các giai đoạn quá trình chuyển gen ở cây đậu tƣơng
3.4.2. Kết quả phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Khi cây đƣợc trồng ra đất tại trại thực nghiệm đã cƣ́ng cáp , sau một tháng chúng tôi tiến hành thu mẫu lá tách DNA tổng số để kiểm tra ban đầu kết quả chuyển gen . Kết quả tách chiết DNA mỗi dòng đậu tƣơng thu đƣợc một băng lớn không bị đƣ́t gãy , phù hợp để tiếp tục phân tích . Tƣ̀ lƣợng DNA tổng số , tiến hành phản ƣ́ng PCR với cặp mồi đặc hiệu của rd29A F/R, sau đó tiến hành phân tích kiểm tra vớ i cặp mồi nhân plasmid của Agrobacterium nhằm kiểm tra xem mẫu phân tích liệu có còn bị nhiễm
Agrobacterium hay không.
Hình 3.19. Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A
và cặp mồi nhân gen virC
(-) sản phẩm PCR DNA tổng số của cây đậu tương đối chứng không chuyển gen; M: thang DNA chuẩn 1 kb; (+) sản phẩm PCR plasmid pBI ::rd29A; (16’, 57’, 64’, 81’): sản phẩm PCR DNA tổng số các dòng đậu tương thu được với cặp mồi n hân gen virC ;
(-) M (+) 16’ 16 57’ 57 64’ 64 81’ 81
~1300 bp 1000 bp
57
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(16, 57, 64, 81): sản phẩm PCR DNA tổn g số các dòng đậu tương thu được với cặp mồi đặc hiệu của promoter rd29A.
Kết quả tiến hành PCR DNA tổng số các dòng đậu tƣơng thu đƣợc 4 dòng dƣơng tính, cụ thể là các dòng 16, 57, 64, 81. Khi tiến hành PCR với cặp mồi của Agrobacterium
thì không thu đƣợc kết quả . Nhƣ vậy , có thể khẳng định các dòng đậu tƣơng thu đƣợc dƣơng tính với PCR là các dòng chuyển gen thành công và không phải do nhiễm
Agrobacterium.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Đã tách dòng đƣợc gen DREB3 giống 100% với gen GmDREB3 mã số DQ055133.1, kích thƣớc 819 bp, mã hóa cho 273 amino acid tƣ̀ RNA tổng số ở cây đậu tƣơng xƣ̉ lý hạn.
1.2. Kết quả phân tích trình tƣ̣ amino acid suy diễn của protein DREB3 cho thấy chƣ́a vùng bảo thủ AP 2 gồm 60 amino acid, tƣ̀ vị trí amino acid số 137 đến số 197. Phân tích vùng AP 2 của protein DREB3 với protein của các gen khác thuộc họ lớn AP 2/ERF cho kết quả: gen DREB3 thu đƣợc thuộc nhóm A6 của họ gen DREB.
1.3. Từ cấu trúc pBI101::rd29A::gus đã t hiết kế thành công vetor chuyển gen pBI::rd29A::DREB3. Trong đó , promoter cảm ứng hạn của gen rd29A điều khiển hoạt động của gen DREB3.
1.4. Đã biến nạp thành công vector chuyển gen mang gen DREB3 vào cây thuốc lá, chọn lọc 40 dòng thuốc lá thu đƣợc đem phân tích , thu đƣợc 21 dòng dƣơng tính với PCR. Kết quả x ử lý hạn đã chƣ́ng minh đƣợc các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng chịu hạn cao hơn so với cây đối chƣ́ng không chuyển gen.
1.5. Để kiểm tra hoạt độ ng của promoter rd29A, chúng tôi tiến hành biến nạp cấu trúc vector pBI ::rd29A::gus vào cây đậu tƣơng và bƣớc đầu thu đƣợc 4 dòng (16, 57,64, 81) dƣơng tính với phản ứng PCR bằng cặp mồi nhân đoạn promoter rd29A.
2. Đề nghị
58
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1. Tiếp tục x ử lý stress môi trƣờng (nhƣ là stress lạnh , mặn…) ở cây đậu tƣơng và cây thuốc lá chuyển gen . Phân tích một s ố chỉ tiêu liên quan đến tính chống chịu của cây với stress môi trƣờng nhƣ: hàm lƣợng proline, độ dài của rễ…
2.2. Tiếp tục theo dõi các dòng thuốc lá và đậu tƣơng chuyển gen ở các thế hệ tiếp theo xem gen đƣợc chuyển có duy trì sƣ̣ ổn định hay không.
2.3. Tiến hành biến nạp vector chuyển gen pBI ::rd29A::DREB3 vào cây đậu tƣơng. Đánh giá kiểm tra các cây đậu tƣơng chuyển gen so sánh với cây đối chƣ́ng trong các điều kiện xử lý stress môi trƣờng.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Bành Thị Mai Anh, Lê Thu Ngọc, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2011), “ Tách dòng gen
mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB3 của đậu tƣơng và đánh giá hoạt động của cấu trúc gen
59
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở thực vật, Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ.
2. Nguyễn Tiến Dũng (2010), “Nghiên cƣ́u biến nạp gen vào đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Luận văn thạc sĩ sinh học.
3. Trần Văn Điển (2007), Giáo trình cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp.
4. Trần Thị Thanh Hảo (2009), “Nghiên cƣ́u tạo cây t huốc lá chuyển gen kháng sâu
vip3A”, Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp.
5. Nguyễn Thu Hiền , Chu Hoàng Mậu , Chu Hoàng Hà , Lê Văn Sơn (2010), “Nghiên cƣ́u khả năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của giống đậu tƣơng (glycine max
L.) DT84 và DT 12 bằng Agrobacterium”, Tạp chí Công nghệ Sinh học , Hội nghị khoa học miền Trung -Tây nguyên.
6. Nguyễn Hiệp Hòa (2010), “Nghiên cƣ́u gen DREB 5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở câ y đậu tƣơng [Glycine max (L.) Merrill]”,
Luận văn thạc sĩ sinh học.
7. Trần Thị Cúc Hòa (2010), “Tạo dòng đậu tƣơng biến đổi gen kháng sâu và chịu hạn”, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
60
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8. Phạm Xuân Hội (2011), Phân lập và thiết kế các vector mang gen điều khiển tính chịu hạn phục vụ công tác tạo giống cây chuyển gen, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
9. Nguyễn Thị Thúy Hƣờ ng (2011), “Phân lập , tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thƣ̉ nghiệm chuyển vào cây đậu tƣơng Việt Nam” , Luận án tiến sĩ sinh học.
10. Trần Thị Phƣơng Liên (2010), Protein và tính chống chịu, Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ.
11. Nguyễn Đƣ́c Thành (2008), Chuyển gen ở thực vật , Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ.
12. Quyền Đình Thi , Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA, tập II, Nxb Khoa học tƣ̣ nhiên và Công nghệ.
13. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
B. TIẾNG ANH
14. Chen M, Wang Q-Y (2007), “GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor cofferred dought and hingh-salt tolerance in transgenic plants”, Biochemical and Biophysical Research Communications 253, 299-305.
15. Chen M, Xu Z, Xia L (2009), “Cold-induced modulation and functional analyses of the DRE-binding transcripton factor gene, GmDREB3, in soybean (Glycine max L.)”,
Journal of Experimental Botany 60(1), 121-135.
16. Dorothea B, Ramanjulu S (2005), “Dought and salt tolerance in palnts”, Critical Reviews in Plant Sciences, 23-58.
17. Enrico M, Kimmen S, Sarah H (2004), “From Endonucleases to Transcription Factors: Evolution of the AP2 DNA Binding Domain in Plants”, The Plant Cell16, 2265–2277.
18. Gao S, Xu H (2005), “Improvement of wheat dought and salt tolerance by expression of a stress-inducible transcription factor GmDREB of soybean (Glycine max)”,
61
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19. Huang B (2006), Plant-environment interactions, Third edition, Spinger, 15-40. 20. Amudha J, Balasubramani G (2011), “Recent molecular advances to combat abiotic stress tolerance in crop plants”, Biotechnology and Molecular Biology Review 6(2), 31-58.
21. Kazuo N, Zabta K-S (2000), “Organization and expression of two Arabidopsis
DREB2 gene encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinity- responsive gene expression”, Plant Molecular Biology 42, 657-665.
22. Kazuo Y-S, Kazuo S (1994), “A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to dought, low-temperature, or high-salt stress, The Plant Cell6, 251-264.
23. Manavalan L-P, Guttikonda S-K (2009), “Physiological and molecular approaches to improve dought resistance in soybean”, Plant Cell Physiology 50, 1260-1276.
24. Li X-P, Tian A-G, Luo G-Z (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”, Theoretical and Applied Genetics, 1355–1362.
25. Liu Q, Mie K, Yoh S (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in dought- and low-temperature –responsive gene expression, respectively, in
Arabidopsis”, The Plant Cell 10, 1391-1406.
26. Liu Q, Zhao N, Shinozaki K-Y (2000), “Regulatory role of DREB transcription factors in plant dought, salt and cold tolerance”, Chinese Science Bulletin45 (11).
27. Mohammad S-I, Wang M-H (2009), “Expression of dehydration responsive element-binding protein-3 (DREB3) under different abiotic stresses in tomato”,
http://bmbreports.org
28. Liu N, Zhong N-Q, Wang G-L (2007), “Cloning and functional characterization of
PpDBF1 gene encoding a DRE-binding transcription factor from Physcomitrella patens”, Planta 226, 827-838.
29. Phan T L-S, Keiichi M (2010), “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions”, Function Integration Genomics, 10, 447–462.
62
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30. Phang T-H, Li M-W (2010), “Molecular responsive to osmotic stresses in soybean”, Soybean – Molecular Aspects of Breeding, chapter 10, 216-239.
31. Pooja Bhatnagar-Mathur, V.Vadez, Kiran K.Sharma (2008), “Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects”, Plant Cell Report, 411- 424.
32. Pradeep K-A, Agarwal P, Reddy M-K (2006), “Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants”, Plant Cell Report, 1263–1274.
33. Stolf-Moreira R, Medri M-E, Neumaier N (2010); “Cloning and quantitative expression analysis of drought-induced genes in soybean”, Genetics and Molecular Research 9, 858-867.
34. Syed S-H, Mahmood A-K, Muhammad A (2011), “Transcription factors as tool to engineer enhanced dought stress tolerance in plants”, Wileyonlinelibrary.com.
35. Yoh S, Kyonnoshin M (2006), “Functional analysis of an Arabidopsis transcription factor, DREB2A, involved in dought-responsive gene expression”, The Plant Cell 18, 1292-1309. 36. Yoshihiro N, Kazuo N (2003), “ Interaction between two cis -acting elements , ABRE và DRE , in ABA-dependent expression of Arabidopsis rd29A gene in responsive to dehydration and high-salinity stresses”, The Plant Journal 34, 137-148.
37. Wang J-W, Yang F-P, Chen X-Q (2006), “Induced Expression of DREB Transcriptional Factor and Study on Its Physiological Effects of Drought Tolerance in Transgenic Wheat”, Acta Genetic Sinica, 33 (5), 468-476.
38. Zhang M, Liu W, Bi Y-P (2009), “Dehydration-responsive element-binding (DREB) transcription factor in plants and its role during abiotic stresses”, Hereditas, 236-244
39. Zhang G, Chen M, Li L, “Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco”, Journal of Experimental Botany60 (13), 3781–3796.
40. Zhou M-L, Ma J-T (2010), “Regulation of plant stress response by dehydration responsive element binding (DREB) transcription factors”, African Journal of Biotechnology9, 9255-9279.
63
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
C. CÁC TRANG WEB 41. http://faostat.fao.org/ 42. www.gso.gov.vn/ 43. http://www.vietrade.gov.vn/ 44. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ 45. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/ 46. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
PHỤ LỤC
Danh mục các trình tự amino acid sử dụng trong nội dung so sánh:
STT Tên Protein MÃ SỐ LOÀI Họ Nhóm
1 GmDREB1 AAP47161 Glycine max DREB A5
2 GhDBP1 AAO43165 Gossypium hirsutum DREB A5
3 GmDREB3 ABB36646 Glycine max DREB A5
4 GmDREBc AAP83131 Glycine max DREB A2
5 GmDREBa AAT12423 Glycine max DREB A2
6 TaDREB1 AAL01124
Triticum aestivum DREB A2
7 OsDREB2A AAN02487
Oryza sativa DREB A2
8 ZmDBF1 AAM80486 Zea Mays DREB A6
9 GhDBP2 AAT39542 Gossypium hirsutum DREB A6
10 GmDERBb AAQ57226 Glycine max DREB A6
11 HvCBF6 AAX23701
Hordeum vulgare DREB A1
12 TaCBF6 AAX28964
Triticum aestivum DREB A1
13 OsDREB1A AAN02486
Oryza sativa DREB A1
14 CsDREB1D BAD67595
Oryza sativa Japonica DREB A1
15 AsCBF1 CAJ21276
Avena sativa DREB A1
16 BCBF1 AAK01088
Hordeum vulgare DREB A1
17 AcCBF AAL35759
Secale cereale DREB A1
18 TaCBF1 AAL37944
Triticum aestivum DREB A1
19 OsDREB1C BAA90812
20 HvCBF2 AAM13419
Hordeum vulgare DREB A1
21 OsDREB1E AAX23722
Oryza sativa DREB A1
22 CaCBF1B AAQ88400
Capsicum annuum DREB A1
23 Cb-CBF AAR26658
Capsella bursa-pastoris DREB A1
24 LeCBF1 AAK57551
Solanum lycopersicum DREB A1
25 BnCBF AAL38243
Brassica napus DREB A1
26 PaDREB1 BAD27123
Prunus avium DREB A1
27 OsDREB1D AAX23723
Oryza sativa DREB A1
28 ZmDBF2 AAM80485 Zea Mays DREB A4
29 TINY2 AAX38232
Arabidopsis thaliana DREB A4
30 ZmABI4 AAM95247 Zea Mays DREB A3
31 GmSGR ABS30430 Glycine max DREB A3
32 ORCA2 CAB93940
Catharanthus roseus ERF
33 ORCA3 ABW77571
Catharanthus roseus ERF
34 AtERF 2 AED95487 Arabidopsis thaliana ERF
35 AtERF 1 AEE32574 Arabidopsis thaliana ERF
36 AtERF 3 AEE32574 Arabidopsis thaliana ERF
37 AtERF 5 AED95489 Arabidopsis thaliana ERF
38 TSI1 AAC14323 Nicotiana tabacum ERF
39 RAV2 BAA34251 Arabidopsis thaliana RAV
40 RAV2 ABY57635 Solanum lycopersicum RAV
41 RAV1 BAA34250 Arabidopsis thaliana RAV
42 RAV1 ABY57634 Solanum lycopersicum RAV
44 AP2 AAG32658
Picea abies AP2
45 RAP 2.7 ACF74549