Tuổi cây mẹ: Cây lấy hom cần ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh. Không nên lấy hom ở những cây già yếu, sâu bệnh hoặc bị chèn ép trong rừng.
Tuổi cành lấy hom: Chọn cành bánh tẻ, cành sinh trưởng tốt, mập, tối thiểu mỗi cành có trên 3 mắt.
4.4.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ sống và ra rễ của hom Mắc khén
Qua thời gian thí nghiệm ta thấy, trong tuần đầu hom Mắc khén ở các công thức hầu như chưa mọc chồi và bước sang tuần thứ 2 trở đi hom bắt đầu mọc chồi. Sau 30 ngày hom bắt đầu có khả năng ra rễ, đối với những hom không ra rễ thì sẽ bị chết hoặc có còn sống thì chỉ kéo dài thêm được khoảng từ 7 - 10 ngày tiếp theo.
Mắc khén là loài cây giâm hom khó ra rễ nên phải sử dụng các biện pháp kỹ thuật tỷ mỷ, kết hợp với sử dụng chất kích thích ra rễ mới thành công được. Đề tài sử dụng chất kích thích ra rễ IBA ở 3 nồng độ khác nhau ( 0,5%, 1% và 1,5%). Kết quả cụ thể được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 4.28: Tỷ lệ sống và ra rễ của hom Mắc khén trong các công thức thí nghiệm
CT
Lần
lặp đem giâm Số hom Số hom sống sống (%) Tỷ lệ Số hom ra rễ Tỷ lệ ra rễ (%) 1 (IBA 0,5%) 1 30 10 33,33 5 16,67 2 30 15 50,00 4 13,33 3 30 20 66,67 6 20,00 TB 30 15 50 5 16,67 2 (IBA 1%) 1 30 13 43,33 9 30,00 2 30 15 50,00 11 36,67 3 30 18 60,00 12 40,00 TB 30 15,33 51,11 10,67 35,56 3 (IBA 1,5%) 1 30 21 70,00 14 46,67 2 30 16 53,33 8 26,67 3 30 23 76,67 12 40,00 TB 30 20 66,67 11,33 37,78 Đối chứng 1 30 7 23,33 1 3,33 2 30 9 30,00 3 10,00
3 30 11 36,67 3 10,00
TB 30 9 30 2,33 7,78
( Kết quả chi tiết được thể hiện tại phụ lục)
Từ bảng 4.28 ta thấy:
- Tỷ lệ sống của hom tại các công thức thí nghiệm dao động từ 30 - 67%, trong đó công thức đối chứng (không sử dụng thuốc kích thích ra rễ IBA) có tỷ lệ sống thấp nhất (đạt 30%), tiếp đến là ở các công thức thí nghiệm sử dụng thuốc kích thích ra rễ IBA ở nồng độ 0,5% và 1% (đạt 50 và 51% hom sống), ở công thức thí nghiệm sử dụng thuốc kích thích ra rễ IBA nồng độ 1,5% có tỷ lệ hom sống cao nhất (đạt 67%), đây là cơ sở quan trọng trong việc hình thành rễ sau này.
- Tỷ lệ ra hom ra rễ ở các công thức thí nghiệm là tương đối thấp, dao động từ 7,8 - 37,78%. Trong đó: Tỷ lệ hom ra rễ cao nhất khi sử dụng IBA ở nồng độ 1,5% (đạt 37,78%), tiếp đến là ở các nồng độ 1% và 0,5% (đạt 35,56% và 16,67%), thấp nhất là ở công thức đối chứng (không sử dụng thuốc kích thích ra rễ) chỉ đạt 7,8% số hom ra rễ.
Kết quả phân tích thống kê cho thấy, tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom ở các công thức thí nghiệm là có sự khác nhau rõ rệt (Sig. < 0,05). Với tiêu chuẩn Duncan cũng cho biết ở nồng độ IBA 1,5% tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom Mắc khén đều đạt cao nhất.
4.4.4. Nhân giống cây Mắc khén bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Hình 4.23: Cây Mắc khén ngoài tự nhiên Hình 4.24: Chồi Mắc khén sau khử trùng
Chất khử trùng cây Mắc khén được thử nghiệm theo 6 công thức với các nồng độ và thời gian khác nhau. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.29.
Bảng 4.29: Tạo mẫu sạch cây Mắc khén in vitro từ chồi thu tại thực địa Công thức Tổng số mẫu Tỉ lệ mẫu sạch (%) Tỉ lệ mẫu sạch sống (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) CT1 60 66,67 37,50 33,33 CT2 30 83,33 44,00 16,67 CT3 40 80,00 31,25 20,00 CT4 60 8,33 80,00 91,67 CT5 20 35,00 28,57 65,00 CT6 20 40,00 25,00 60,00
Kết quả ở bảng 4.29 cho ta thấy, công thức CT4 cho tỉ lệ mẫu nhiễm cao nhất là 91,67%, tỉ lệ mẫu sạch là 8,33% và tỉ lệ mẫu sạch sống là 80,00%. Tỷ lệ mẫu nhiễm cao nhất là do công thức này không xử lý mẫu trong dung dịch kháng sinh Cefotaxime và dung dịch nước oxy già. Các chất khử trùng có khả năng ngăn chặn sự sinh trưởng và tiêu diệt các vi sinh vật bám trên bề mặt của mô cấy cũng như các phần mô tiếp xúc với chúng. Do mô cấy không được xử lý với kháng sinh và nước oxy già nên các vi sinh vật bám trên bề mặt và trong mô dẫn không được
xử lý triệt để dẫn đến tỷ lệ mẫu nhiễm ở công thức này là cao nhất. Khi tăng nồng độ, thành phần các chất khử trùng và thời gian xử lý mẫu lên thì tỉ lệ mẫu nhiễm giảm xuống nhưng tỉ lệ mẫu sạch chết lại tăng lên. Công thức khử trùng cho tỷ kết quả tốt nhất là công thức 2 với tỉ lệ mẫu sạch cao nhất 83,33% trong đó, tỉ lệ mẫu sạch sống 44,00%, tỉ lệ mẫu nhiễm là 16,67% (hình 4.25).
Mẫu cây Mắc khén được thu thập từ thực địa vẫn được đánh giá là rất khó khử trùng do là cây lâu năm, sống trong tự nhiên nên các bào tử nấm, vi khuẩn xâm nhập vào sâu trong mô dẫn của cây. Bên cạnh đó, việc khử trùng hầu như chỉ có tác dụng ở bề mặt mô cấy, do đó khả năng tái nhiễm đối với vi khuẩn và nấm sau khử trùng là rất cao. Kết quả khử trùng cây Mắc khén cũng cho thấy, cây Mắc khén là một loài cây khó khử trùng và nhạy cảm với các chất khử trùng.
Hình 4.25: Chồi Mắc khén phát triển từ mắt ngủ
A: Mẫu sạch B,C: Mẫu nhiễm khuẩn D: Mẫu nhiễm nấm
B A
C
4.4.4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và BAP đến khả năng phát triển chồi
Trong nhân giống in vitro, môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trong quá trình nuôi cấy. Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng gây ảnh hưởng chọn lọc đến các gen, kích thích sự phát sinh hình thái và phân hóa theo những hướng khác nhau của các tế bào trong nuôi cấy in vitro. Tỉ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát triển hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi để tạo mô sẹo và rễ cần có tỉ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sản sinh chồi và chồi nách [40]. Do đó, trong đề tài này tiến hành thử nghiệm các tổ hợp giữa IBA và BAP khác nhau để đánh giá khả năng phát triển của các chồi Mắc khén. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.30.
Bảng 4.30: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát triển chồi cây Mắc khén CT môi trường Tổng số mẫu Tỉ lệ chồi được phát triển (%) Tỉ lệ chồi bị tái nhiễm (%) Chiều cao TB của chồi (cm) TS0 10 100 50,00 0,20 TS1 15 100 46,67 0,36 TS2 15 100 60,00 0,51 TS3 15 100 33,33 0,81 TS4 15 100 40,00 1,43 TS5 15 100 66,67 1,10 TS6 15 100 33,33 0,83 TS7 15 100 53,33 0,64 TS8 15 100 60,00 0,39
Hình 4.26: Ảnh hưởng của tổ hợp IBA và BAP đến khả năng phát triển chồi
Kết quả ở bảng 4.30 và hình 4.26 cho thấy, tỉ lệ chồi được phát triển của các công thức là 100% nhưng tốc độ phát triển chồi ở các công thức lại có sự khác biệt rõ rệt, dao động từ 0,2cm (TS0) đến 1,43cm (TS4). Sự tăng nồng độ BAP từ 0 cho đến 2,1mg/l tỷ lệ thuận với kích thước của chồi đạt được, khi nồng độ BAP tiếp tục tăng đến 4mg/l thì lại làm cho kích thước của các chồi đạt được bị giảm dần. Như vậy, tổ hợp 0,5mg/l IBA và BAP ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng phát triển của chồi Mắc khén.
Số chồi trung bình đạt được ở tất cả các công thức đều là 1 chồi/mẫu, điều này có thể là do ảnh hưởng của ưu thế ngọn vì các chồi đều đã bắt đầu phát triển trên môi trường MS từ một mắt ngủ, kích thước các chồi quá nhỏ nên không tiến hành loại bỏ ưu thế ngọn trước khi chuyển sang môi trường có IBA và BAP.
Trước khi đưa vào môi trường tái sinh các mẫu cấy đã được khử trùng và tạo được mẫu sạch bề mặt. Nhưng sau khi đưa vào môi trường tái sinh các mẫu đã bật chồi thì hiện tượng mẫu tái nhiễm khuẩn và nhiễm nấm vẫn xuất hiện do đặc trưng của các loài cây rừng các bào tử nấm và tế bào vi khuẩn nằm trong mô, trong mạch gỗ của mẫu. Ở các công thức thí nghiệm, tỷ lệ mẫu tái nhiễm là rất cao, dao động từ 33,33 đến 66,67%. Điều này có thể là do các bào tử nấm và vi khuẩn vẫn tồn tại trong mô dẫn ở phần mô cấy và sau một thời gian các bào tử đó phát triển gây ra sự tái nhiễm mẫu. Mặt khác, điều kiện phòng thí nghiệm chưa thực sự đảm bảo, thời
TS0
TS1
tiết mưa nhiều làm cho phòng nuôi cấy bị ẩm mốc dẫn đến tỷ lệ nhiễm mẫu cao ở tất cả các công thức thí nghiệm.
Hình 4.27: Chồi cây Mắc khén tái nhiễm khuẩn và nấm
A: Chồi tái nhiễm khuẩn; B: Chồi tái nhiễm nấm
4.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài của chồi
Hiệu quả rõ rệt nhất của GA3 là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều cao của thân, chiều dài của cành, rễ, đặc biệt là ở nhóm cây hòa thảo. Hậu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của GA3 lên sự dãn theo chiều dọc của tế bào thực vật [40].
Bảng 4.31: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi cây Mắc khén CT môi trường Số cụm phôi được cấy Số mẫu nuôi cấy Tỉ lệ chồi kéo dài (%) Chiều cao TB chồi (cm) Tỉ lệ chồi tái nhiễm (%) Chất lượng chồi KD0 0 9 44,44 0,62 44,44 + KD1 0,3 15 40,00 0,99 40,00 + KD2 0,5 15 60,00 1,32 53,33 ++ KD3 0,7 15 73,33 1,57 46,67 +++ A B
Ghi chú: Chất lượng chồi (+): chồi phát triển chậm, còi cọc, lá nhỏ,chưa phát triển
hết; (++): Chồi phát triển tốt, chồi to, lá phát triển đầy đủ; (+++): Chồi phát triển tốt, cao, lá xanh và dài.
Kết quả ở bảng 4.31 cho thấy, các nồng độ GA3 khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến sự kéo dài của chồi. Ở công thức KD0 khi môi trường không bổ sung GA3, sự kéo dài chồi diễn ra chậm nhất (chiều cao trung bình đạt 0,62cm), nồng độ GA3 tăng đến 0,7mg/l làm cho sự kéo dài chồi cũng tăng lên rõ rệt, ở nồng độ 0,7mg/l sự kéo dài chồi Mắc khén đạt được là tốt nhất (1,57cm). Chất lượng chồi cũng chịu ảnh hưởng rõ rệt của nồng độ GA3, nhưng đồng thời khi chồi phát triển càng nhanh thì khả năng tái nhiễm của chồi càng tăng lên 46,67% trong khi ở chiều cao 0,99 cm tỉ lệ chồi tái nhiễm chỉ ở mức 40%.
Công thức có bổ sung 0,7mg/l GA3 kéo dài chồi cao nhất thì chất lượng chồi là tốt, mập mạp, lá xanh, sức sống tốt.
Hình 4.28: Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi cây Mắc khén
4.4.4.4. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt
Hạt cây Mắc khén sau khi khử trùng được rửa sạch bằng nước cất sau đó dùng lưỡi dao nhọn và kẹp bóc lớp vỏ cứng ở ngoài sau đó dùng dao khía vào lớp vỏ màu nâu bao bọc hạt bên trong lớp vỏ cứng màu đen vì lớp vỏ này rất dai hạt rất khó bật chồi.
Do hạt Mắc khén bé nên các thao tác cần phải được tiến hành cẩn thận nhẹ nhành ở trong box cấy tránh làm ảnh hưởng đến phôi giảm tỉ lệ nảy mầm của hạt.
KD0 KD1 KD3
Kết quả nghiên cứu xử lý hạt giống bằng phương pháp đốt ủ đạt tỉ lệ nảy mầm cao nhất điều này chứng tỏ hạt Mắc khén phải cần nhiệt độ để kích thích hạt nảy mầm. Từ lý do trên sau khi hạt được cấy vào môi trường trong tuần đầu ta cho mẫu cấy vào trong tủ sấy để nhiệt độ ở mức 300C để kích thích hạt nảy mầm.
Bảng 4.32: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Thời gian khử trùng (phút) Số hạt cấy (hạt) Tỉ lệ hạt nảy mầm (%) Tỉ lệ hạt không nảy chồi (%) Tỉ lệ hạt hạt bị nhiễm (%) 15 45 4,44 75,56 20,00 30 45 11,11 73,33 15,56 45 45 20,00 71,11 8,89
Qua kết quả bảng 4.32 ta thấy, khử trùng trong thời gian 15 phút số hạt nảy mầm thấp nhất chỉ 4,44% nhưng tỉ lệ hạt không nảy chồi và số hạt bị nhiễm lại chiếm tỉ lệ cao nhất 75,56% và 20%. Thời gian khử trùng 45 phút cho tỉ lệ số hạt nảy mầm cao nhất 20% và tỉ lệ số hạt bị nhiễm thấp nhất 8,89%. Ở các thời gian khử trùng 15; 30; 45 phút ta thu được kết quả khác nhau. Thời gian khử trùng ngắn số hạt nảy mầm thấp nhất do vỏ cây Mắc khén cứng nổi trên bề mặt dung dịch.
Khử trùng ở thời gian 45 phút hạt nảy mầm nhiều hơn nhưng tỉ lệ hạt Mắc khén nảy mầm rất thấp có thể do một số nguyên nhân sau:
- Thời gian khử trùng vẫn chưa đủ để kích thích hạt nảy mầm.
- Trong thao tác bóc vỏ hạt do hạt rất bé và khó bóc nên đã vô tình làm ảnh hưởng đến phôi của hạt.
- Chưa tìm ra được nhiệt độ thích hợp cho việc nảy mầm của hạt Mắc khén.
4.5. Kỹ thuật gây trồng và phát triển cây Mắc khén
4.5.1. Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng, phát triển của cây Mắc khén sau 4 năm trồng
* Sinh trưởng về đường kính D1.3, chiều cao HVN và đường kính tán (DT) trong các công thức bón phân
Kết quả nghiên cứu về đường kính D1.3, chiều cao (HVN) và đường kính tán của cây Mắc khén sau 4 năm trồng ở các công thức thí nghiệm bón phân được thể hiện qua bảng 4.33.
Bảng 4.33: Sinh trưởng về D1.3, HVN, DT của cây Mắc khén trong các công thức bón phân Lần lặp Công thức D1.3(cm) HVN(m) DT(m) D S% H S% D S% 1 NPK 50 gam/hố 9,49 11,24 6,57 10,16 3,76 31,63 1 NPK 100 gam/hố 9,61 12,58 6,56 12,94 3,72 10,72 1 NPK 150 gam/hố 9,65 12,17 6,83 12,94 3,67 38,16 1 Không bón phân NPK 9,13 12,35 6,30 12,81 3,54 48,87 2 NPK 50 gam/hố 9,50 11,18 6,50 10,13 3,70 31,65 2 NPK 100 gam/hố 9,60 12,51 6,50 12,85 3,70 10,82 2 NPK 150 gam/hố 9,65 12,14 6,50 12,85 3,67 38,09 2 Không bón phân NPK 9,40 12,25 6,30 12,70 3,30 49,38 3 NPK 50 gam/hố 9,52 11,21 6,65 10,11 3,48 31,58 3 NPK 100 gam/hố 9,46 12,56 6,50 12,95 3,49 10,78 3 NPK 150 gam/hố 9,66 12,13 6,84 12,92 3,79 38,32 3 Không bón phân NPK 9,43 12,36 6,51 12,76 3,32 49,46
Qua bảng 4.33 ta thấy: Sinh trưởng D1.3 của cây Mắc khén tại các công thức bón phân dao động từ 9,13cm (CT: Không bón phân NPK) đến 9,66cm (CT: Bón NPK 150 gam/hố); sinh trưởng về chiều cao vút dao động từ 6,30m (CT: Không bón phân NPK) đến 6,84m (CT: Bón NPK 150 gam/hố); sinh trưởng đường kính tán dao động từ 3,30m (CT: Không bón phân NPK) đến 3,79m (CT: Bón NPK 150 gam/hố). Kết quả kiểm tra phương sai đa biến cho ta thấy: Ở các công thức bón phân khác nhau chưa có sự sai khác rõ rệt đến chỉ tiêu tổng hợp
về sinh trưởng D1.3, HVN và DT ( Sig. > 0,05). Tuy nhiên, khi kiểm tra riêng lẻ các chỉ tiêu cho kết quả: Ở các công thức bón phân khác nhau có sự sai khác rõ rệt sinh trưởng về D1.3 và HVN , còn ảnh hưởng của các công thức bón phân khác nhau đến sinh trưởng DT là không rõ. Tiêu chuẩn Duncan cho biết: Ở công thức bón phân NPK 150 gam/hố đều cho sinh trưởng về D1.3, HVN và DT trội nhất. Như vậy, khi bón lót phân NPK cũng có những ảnh hưởng nhất định đến một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây Mắc khén.
* Năng suất quả Mắc khén trong các mô hình bón phân
Bảng 4.34: Năng suất quả cây Mắc khén trong các công thức bón phân
Loài cây Năng suất bình quân/cây (kg) Mật độ