Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.2.2.1. Phương pháp kế thừa

- Các báo cáo, các tài liệu khoa học đã công bố về cây Mắc khén.

- Số liệu đã có về điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội, tình hình gây trồng, phát triển loài cây Mắc khén, thị trường và những khó khăn, tồn tại cần giải quyết.

Thu thập và phân tích các tài liệu đã

có

Lựa chọn địa điểm nghiên cứu chi tiết

Nghiên cứu đặc điểm vật

hậu của cây Mắc khén Nghiên cứu giá trị sử dụng của cây Mắc khén Nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Mắc khén Nghiên cứu kỹ thuật gây trồng và phát triển cây Mắc khén Tổng hợp, phân tích, đánh giá các kết quả nghiên cứu

Điều tra khảo sát sơ bộ khu vực nghiên cứu Nghiên cứu thị trường và các biện pháp sơ chế các sảnphẩm từ hạt cây Mắc khén Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân bố, sinh thái, cấu trúc, tái sinh cây Mắc khén

Đề xuất các biện pháp kỹ thuật gây trồng và phát triển cây Mắc khén

2.2.2.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân bố, sinh thái, cấu trúc và tái sinh cây Mắc khén

* Đặc điểm hình thái:

Áp dụng phương pháp kế thừa số liệu; quan sát tại hiện trường, so sánh trên cơ sở các dữ liệu ngoài thực địa, sau đó giải phẫu trong phòng thí nghiệm, so sánh các mẫu vật thu được lưu giữ qua bộ tiêu bản và hình ảnh, phân tích, tổng hợp.

* Đặc điểm phân bố và sinh thái:

Kế thừa các công trình nghiên cứu về phân bố và sinh thái của cây Mắc khén và bản đồ hiện trạng tài nguyên rừng của tỉnh Sơn La; tiến hành khảo sát sơ bộ khu vực nghiên cứu, từ đó lập 9 tuyến điều tra xuyên qua các dạng địa hình, các đai cao, các trạng thái rừng, tập trung chủ yếu các khu vực có cây Mắc khén phân bố, chiều rộng tuyến 100m.

- Tuyến 1: Từ thị trấn Thuận Châu đi dọc đường tỉnh lộ 108, theo đường lấy củi của người dân đến trung tâm khu rừng đặc dụng Côpia, chiều dài 32 km.

- Tuyến 2: Từ thị trấn Thuận Châu đi theo quốc lộ 279, theo đường mòn qua thị trấn Quỳnh Nhai đến giáp ranh với huyện Than Uyên, tỉnh Lai Châu, chiều dài 92 km.

- Tuyến 3: Từ thành phố Sơn La đi dọc theo đường liên huyện qua thị trấn Mường La, theo các đường mòn, đường lấy củi của người dân đến giáp ranh huyện Than Uyên, tỉnh Lai Châu, chiều dài 80 km.

- Tuyến 4: Từ thành phố Sơn La đi dọc theo đường liên huyện, theo đường mòn qua thị trấn Sông Mã, khu rừng đặc dụng Sốp Cộp đến thị trấn Sốp Cộp, chiều dài 120 km.

- Tuyến 5: Từ thành phố Sơn La đi dọc theo quốc lộ 4G, theo đường mòn, đường liên xã đến giáp ranh thị trấn Mai Sơn, chiều dài 45 km.

- Tuyến 6: Từ thị trấn Mai Sơn đi dọc theo đường liên xã, đường mòn đến giáp ranh huyện Sông Mã, chiều dài 45 km.

- Tuyến 7: Từ ngã ba Còi Nòi huyện Mai Sơn đi dọc theo quốc lộ 37, theo đường mòn, đường lấy củi của người dân qua thị trấn Bắc Yên đến giáp ranh huyện Mù Cang Chải, tỉnh Lào cai, chiều dài 145 km.

- Tuyến 8: Từ thị trấn Bắc Yên dọc theo quốc lộ 37, theo đường mòn, qua thị trấn Phù Yên đến giáp ranh huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ, chiều dài 75 km.

- Tuyến 9: Từ thị trấn Mộc Châu dọc theo tỉnh lộ 37, theo đường lấy củi của người dân đến giáp ranh huyện Mai Châu, tỉnh Hòa Bình, chiều dài 110 km.

Quá trình điều tra định vị trên máy GPS, thu thập số liệu về vị trí địa lý, địa hình, độ cao, độ dốc, loại rừng,… Thu thập số liệu khí hậu thủy văn tại các trạm quan trắc của khu vực nghiên cứu (Trạm khu vực Tây Bắc) từ năm 2006 - 2011.

Trong mỗi đai cao có cây Mắc khén phân bố tiến hành đào 3 phẫu diện đất, mô tả và lấy mẫu phân tích. Mẫu đất được lấy ở các độ sâu: 0 - 20cm; 40 - 60cm theo tầng đất, mỗi mẫu lấy 0,5 - 1 kg. Các chỉ tiêu phân tích gồm: Hàm lượng mùn (%) theo phương pháp Walkley-Black; Đạm (N%) bằng phương pháp Kjendhal; P2O5 dễ tiêu theo phương pháp Bray II; K2O dễ tiêu theo phương pháp Flame photometer; Độ chua trao đổi theo ISRie; độ chua thủy phân theo phương pháp Kappen; pH đo trên máy pH metress; Cation trao đổi (Ca++ và Mg++) bằng phương pháp chuẩn độ Trilon B, rút tinh bằng NaCl 1N; thành phần cơ giới theo phương pháp USDA và phân cấp theo 3 bậc của Mỹ.

Mẫu đất được phân tích tại Viện Quy hoạch và thiết kế nông nghiệp.

* Cấu trúc rừng tự nhiên có cây Mắc khén phân bố:

Điều tra tầng cây cao trên các đai cao < 700m, 700 - 1.000m và > 1000m, nơi có Mắc khén phân bố, mỗi đai cao điều tra 3 ÔTC điển hình tạm thời, vị trí các ÔTC được định vị bằng máy GPS, diện tích ÔTC là 2500m2 (50m x 50m), trong ÔTC chia thành mạng lưới 25 ô thứ cấp diện tích 100m2 (10m x10m). Trong các ô thứ cấp xác định tên cây và đo đếm toàn bộ theo các chỉ tiêu: D1,3(từ 6cm trở lên); Hvn; Hdc; Dt; Lt. Vẽ trắc đồ đứng và ngang theo băng 50m x 10m (theo Rollet, 1964).

Tổ thành loài được tính theo phương pháp của Curtis Mc. Intosh, 1951 (theo Bảo Huy, 1993, 1997) 1. Tổ thành loài cây được xác định theo phần trăm (%) giá trị quan trọng IV (Importance Value) của một loài cây nào đó trong tổ thành của rừng. Theo Daniel Marmilod thì những loài có giá trị IV ≥ 5% là loài cây ưu thế trong tổ thành của lâm phần (dẫn theo 1).

Trị số IV được tính theo công thức:

2 % % (%) N G IV   (2.1) 100 /ha) (m phÇn m l trong loµi c¸c cña G /ha) (m a loµi cña g (%) 2 2 x G â    (2.2) 100 â đ đ (%) x N phÇn m l cña é MËt a loµi cña é MËt  (2.3)

F tổng số ô xuất hiện tất cả các loài.

N (cây/ha) = n1 + n2 + …. + nn (mật độ lâm phần).

G (m2/ha) = g1 + g2 + …. + gn (G là tổng tiết diện d1,3 của các loài trong lâm phần); gi là tiết diện của loài i.

- Xác định mối quan hệ của Mắc khén với các loài cây ưu thế trong lâm phần:

Để định lượng mối quan hệ giữa 2 loài A và B với nhau (cặp loài) đề tài dựa vào hệ số tương quan theo công thức sau (2.4):

       A P A P B  P B  P B P A P AB P - 1 ). ( . - 1 . -   (2.4)

Trong đó  là hệ số tương quan giữa 2 loài A và B. Gi: + nA là số ÔTC chỉ xuất hiện loài A.

+ nB là số ÔTC chỉ xuất hiện loài B

+ nAB là số ÔTC đồng thời xuất hiện cả loài A và B. + n là số ÔTC ít nhất có 2 loài A và B xuất hiện. Ta có:   n n B A P .  AB ;   n nAB n A P A  ;   n nAB n B P B  

Nếu 0 <  < 1 thì loài A và B có liên kết dương và  càng lớn thì mức độ hỗ trợ nhau càng lớn.

Nếu -1 <  < 0 thì loài A và B có liên kết âm và  càng lớn thì mức độ bài xích lẫn nhau càng mạnh.

* Trường hợp  không lớn lắm thì chưa thể biết giữa 2 loài có thực sự quan hệ với nhau hay không? Để có kết luận cụ thể cần sử dụng phương pháp kiểm tra tính độc lập bằng tiêu chuẩn 2, được tính theo công thức:

  a bc da cb d n bc ad        0,5 . 2 2  (2.5)

Trong đó: a = nAB; b= nB; c= nA; d là số ô không có cả 2 loài A và B. 2 tính được so sánh với 2 05  ứng với bậc tự do k=1; ( 2 05  = 3,84). Nếu 2 ≤ 2 05

 thì mối quan hệ giữa 2 loài là ngẫu nhiên. Nếu 2 > 2

05

 thì mối quan hệ giữa 2 loài có quan hệ lẫn nhau.

Vì vậy, đề tài sử dụng đồng thời 2 tiêu chuẩn  và 2 để xem xét mối quan hệ theo từng cặp loài. Dùng tiêu chuẩn 2 kiểm tra sự tồn tại mối quan hệ từng cặp loài; Dùng hệ số tương quan  vừa để đánh giá mức độ quan hệ qua giá trị , vừa định hướng chiều hướng mối quan hệ theo dấu của  (- hay +) nếu tiêu chuẩn 2

kiểm tra cho kết quả chúng có quan hệ (Bảo Huy, 1997), (Nguyễn Hải Tuất, 1982) 1.

* Đặc điểm tái sinh tự nhiên:

Điều tra cây tái sinh được tiến hành đồng thời với điều tra ÔTC. Trong mỗi ÔTC thiết lập 30 ô dạng bản (ÔDB) diện tích 4m2 (2m x 2m), các ÔDB được bố trí hệ thống trên 5 tuyến song song cách đều, khoảng cách mỗi tuyến là 10m, mỗi tuyến được bố trí 6 ÔDB, mỗi ÔDB cách nhau 5m, 2 ô ngoài cùng cách cạnh ÔTC là 6,5m. Các chỉ tiêu xác định: Loài cây, Hvn, phẩm chất cây, nguồn gốc cây tái sinh. Phẩm chất cây tái sinh phân làm 3 cấp:

+ Cây tốt (A): là cây sinh trưởng tốt, thân tròn thẳng, tán lá phát triển đều, không sâu bệnh, khuyết tật.

+ Cây trung bình (B): là cây sinh trưởng bình thường, ít khuyết tật. + Cây xấu (C): là cây sinh trưởng kém, cong queo, khuyết tật, sâu bệnh. Cây triển vọng là cây thuộc loài mục đích, sinh trưởng tốt, chiều cao vượt trên lớp cây bụi, thảm tươi xung quanh, và có phẩm chất trên trung bình.

- Mật độ tái sinh được tính theo công thức:

4 30 1 10 120 ) / ( x n ha cây N i   (2.6)

Trong đó: ni: là số cây trong ÔDB

- Xác định hệ số tổ thành loài cây tái sinh

Hệ số tổ thành cây tái sinh được tính theo công thức:

(2.7)

Trong đó:

A: Hệ số tổ thành cây tái sinh

m: Số cá thể mỗi loài trong ô tiêu chuẩn n: Tổng số cây trong ô tiêu chuẩn

- Phân bố số cây tái sinh theo chiều cao

Đề tài chia chiều cao theo 4 cấp: Cấp I (H < 1m); Cấp II (1,0 - 2,0m); Cấp III (2,0 - 3,0m); Cấp IV (> 3m). Số cây từng cấp chiều cao được tính như sau:

4 30 1 10 120 ) / ( x n ha cây N i   (2.8)

Trong đó: ni là số cây từng cấp trong ÔDB

- Chất lượng cây tái sinh và nguồn gốc tái sinh

Số cây tái sinh ở từng cấp chất lượng và nguồn gốc được tính theo công thức

4 30 1 10 120 ) / ( x n ha cây N i   (2.9)

Trong đó: ni là số cây của từng chấp lượng (A hoặc B hoặc C) hay hạt hoặc chồi trong ÔDB.

2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vật hậu cây Mắc khén

Áp dụng phương pháp kế thừa số liệu và điều tra khảo sát bổ sung ngoài hiện trường: Đề tài áp dụng thang phân chia đai cao của Thái Văn Trừng [37], [38], [39], [57], [61], chia đai cao khu vực nghiên cứu thành 3 đai: i) < 700m; ii) từ 700 - 1000m và iii) > 1000m. Trên mỗi đai độ cao quan sát 5 cây mẹ Mắc khén trung bình (cây tiêu chuẩn) đại diện cho các cây ở khu vực nghiên cứu, cây sinh trưởng tốt, thân thẳng, không cong queo, sâu bệnh, trên mỗi cây mẹ đánh dấu 3 cành tiêu chuẩn trung bình ở 3 vị trí tán: Ngọn, giữa và dưới tán. Theo dõi, quan sát trong 3 năm với các chỉ tiêu sau:

- Thời kỳ thay đổi lá; thời kỳ ra chồi, ra hoa, nở hoa, kết quả; thời kỳ quả chín, rơi rụng.

- Chu kỳ sai quả (Kiểm tra sự sai khác giữa các năm bằng phương pháp phân tích phương sai 1 nhân tố với 3 lần lặp lại [62]. Kết quả nghiên cứu được xử lý trên phần mềm SPSS 16.0).

- Mối quan hệ giữa hình thái vỏ quả và kích thước hạt: Thí nghiệm được bố trí ở 3 đai cao, với 3 công thức hình thái vỏ quả, cụ thể như sau: CT1: Hạt ở lô vỏ quả còn xanh; CT2: Hạt ở lô vỏ quả chín và CT3: Hạt ở lô vỏ quả bắt đầu nứt. Quả được hái đem về phơi khô và tách hạt rồi tiến hành đo đếm (100 hạt/lần) các chỉ tiêu cần đánh giá như đường kính và độ dày của hạt, mỗi công thức bố trí ngẫu nhiên lặp lại 3 lần. Kết quả thí nghiệm đánh giá thông qua phương pháp phân tích phương sai 2 nhân tố.

2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu giá trị sử dụng của cây Mắc khén

* Nghiên cứu kiến thức bản địa của một số cộng đồng dân tộc thiểu số trong sử dụng các sản phẩm từ cây Mắc khén:

Phương pháp sử dụng là Đánh giá nông thôn có sự tham gia, sử dụng bộ công cụ PRA để phỏng vấn (hộ gia đình, các quán ăn dân tộc, các cửa hàng của người dân tộc thiểu số chế biến có sử dụng gia vị quả Mắc khén) [46], [60].

* Phân tích hoạt tính có trong một số bộ phận cây Mắc khén (Chi tiết thể hiện trong phần phụ biểu):

Mục đích: So sánh thành phần tinh dầu có trong thành phần quả và lá cây Mắc khén, tìm ra các chất hoặc hợp chất thơm sử dụng trong làm gia vị, thử hoạt tính độc tế bào đối với tinh dầu cất được từ quả đối với một số loại tế bào ung thư ở người.

- Tách tinh dầu và phân tích tinh dầu:

+ Phương pháp chưng cất tinh dầu: Mẫu Mắc khén (Quả ký hiệu ZRS và lá ký hiệu ZRL), mẫu tươi được nhặt riêng quả, lá xay nhỏ và vào bình cầu, thêm nước vào khoảng 2/3 bình, và chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong thời gian 3 giờ ở áp suất thường [80]. Quả khô xay nhỏ (140g) được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong thời gian 3 giờ ở áp suất thường [76] thu được 2,86 g (2,04% tính theo lượng mẫu khô).

- Chiết, tách phân tích thành phần hóa học:

Mẫu tinh dầu được xác định thành phần hoá học bằng máy sắc ký khí - khối phổ liên hợp (GC/MS) trên cơ sở so sánh với thư viện dữ liệu phổ WILEY7.LIB, NIST27.LIB, NIST147.LIB, SZTERP.LIB

- Phương pháp xác định sơ bộ thành phần các cặn dịch chiết :

Trước khi tiến hành các phương pháp sắc ký cột để phân tách chất, các mẫu cao chiết tổng MeOH được chiết phân lớp lần lượt với: n-hexan, EtOAc và BuOH. Loại dung môi dưới áp suất giảm và cặn chiết tương ứng được tiến hành phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (ký hiệu SKLM, hoặc TLC) với các hệ dung môi thích hợp và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định sơ bộ thành phần và hàm lượng của các cấu tử trong các cao chiết, giúp cho việc định hướng và theo dõi quá trình phân lập chất một cách có hệ thống.

- Phương pháp chiết, tách các chất từ quả:

140 g mẫu quả Mắc khén (ZRS) đã phơi khô và xay nhỏ được ngâm chiết bằng MeOH-H2O (95 :5) ở nhiệt độ phòng, dung môi được cất loại dưới áp suất giảm (45-500C) thu được cao tổng metanol (ZRSM, 12,8g). Hòa tan 12g cao metanol trong nước cất (khoảng 50ml) và tiến hành chiết lỏng-lỏng cao tổng metanol trong các dung môi khác nhau theo nguyên lý phân bố với các dung môi có độ phân cực tăng dần từ n-hexan,ethyl acetat (EtOAc) và butanol (BuOH), cất loại

dung môi thu được cặn các dịch chiết n-hexan (1g), EtOAc (3g) và BuOH (5g) tương ứng.

Cặn dịch chiết EtOAc được phân tách thành 7 phân đoạn chính (ký hiệu là ZR1ZR7) bằng sắc ký cột trên silicagel, dung môi giải hấp là hexan-CH2Cl2

(9:11:9) và tăng dần phân cực (gradient) CH2Cl2-MeOH (99:190:10). Chất ZRS1 (TB-S1) được kết tinh từ phân đoạn 1 (EtOAc) dạng bột màu trắng, không hiện dưới đèn UV.

- Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết :

+ Hoạt tính kháng sinh với các chủng vi sinh: Lactobacillus fermentum,

Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida albican. + Hoạt tính chống oxy hóa.

+ Hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư người: KB (ung thư mô biểu bì), HepG2 (ung thư gan), MCF7 (ung thư vú) và Lu (ung thư phổi).

- Xác định cấu trúc : Các cấu tử được tách ra từ các phân đoạn được xác định cấu trúc hóa học bằng việc kết hợp các phương pháp phổ: phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D: 1H-NMR, 13C-NMR, phổ 2D: HSQC, HMBC,